Fachbereich Veterinärmedizin


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    Vergleichende molekulare und funktionelle Analyse des "Locus of Enterocyte Effacement" (LEE) im bovinen EHEC-Stamm RW1374 (O103:H2) (2008)

    Art
    Hochschulschrift
    Autor
    Behrend, Sylke
    Quelle
    Berlin: Mensch & Buch Verl., 2008 — 125 Seiten
    ISBN: 978-3-86664-391-8
    Verweise
    URL (Volltext): http://www.diss.fu-berlin.de/diss/receive/FUDISS_thesis_000000004438
    Kontakt
    Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen

    Robert-von-Ostertag-Str. 7-13
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    Abstract / Zusammenfassung

    Humane Infektionen mit enterohämorrhagischen E. coli (EHEC) der Serovar O103:H2 gewinnen in Deutschland zunehmend an Bedeutung. Da Wiederkäuer als transientes EHEC Reservoir mehrheitlich für die humanen Infektionen verantwortlich sind, haben wir die DNS einer Pathogenitätsinsel (PAI) des bovinen O103:H2 Stamms RW1374 analysiert, um putative Virulenzmerkmale zu identifizieren. Diese komplex zusammengesetzte PAI beinhaltet die Kernregion des „Locus of Enterocyte Effacement“ (LEE) und ein Homolog der genetischen O-Insel (OI-) 122, bestehend aus den virulenzassoziierten Genen efa1/lifA, ent, nleE, nleB und einigen mobilen Elementen. Sie hat eine Gesamtlänge von 111 kb und ist im pheV-tRNS-Locus inseriert. Die Kombination mehrerer komplexer Virulenzmerkmale könnte teilweise die hohe Virulenz der EHEC Serovar O103:H2 für den Menschen erklären.
    Beim Vergleich der PAI mit homologen Loci von humanen EPEC (O127:H6) und EHEC (O157:H7; O26:NM) sowie Kaninchen-spezifischen EPEC (O103:H2; O15:H-) zeigte sich die LEE-Kernregion weitgehend konserviert, während die OI-122 deutliche Unterschiede aufwies. In der LEE-Kernregion des RW1374 fehlen der Orf3 und das ERIC-Element, die Gene für EspF und Ler weichen von den Homologen der anderen Stämme ab. Der OI-122 fehlt das pagC Gen, das efa1/lifA Gen wird von zwei Insertionssequenzen (IS) flankiert und das Integrasegen am 5’-Ende der PAI durch ein IS629 Element zerstört.

    Um nähere Aufschlüsse über die Verbreitung der OI-122 zu erhalten, wurden 268 intestinale E. coli-Isolate mittels PCR und DNS-DNS-Hybridisierung auf das Vorkommen der Gene pagC, ent und efa1/lifA bzw. efa1’ untersucht. Während das trunkierte efa1’ Gen ausschließlich in EHEC der Serovar O157:H7 vorkam, wiesen 27 % der Isolate verschiedener Serovare das efa1/lifA auf. In drei Stämmen fanden wir Hinweise auf neuartige efa1/lifA Genvarianten. Das Gen ent besaßen 44 % und das Gen pagC 22 % der überprüften E. coli. Zwei oder drei der Gene identifizierten wir ausschließlich in Attaching-and-Effacing (A/E-) Läsionen-verursachenden E. coli (AEEC). Von den 164 AEEC hatten 31 % eine vollständige und 26 % eine unvollständige Version der OI-122. Die nicht-AEEC wiesen maximal eines der Gene auf. Die Ergebnisse weisen auf eine deutliche Assoziation zwischen der genetischen Insel und dem LEE hin. In einigen Stämmen konnten wir eine direkte Nachbarschaft der beiden Inseln feststellen.
    Die Ermittlung effizienter Strategien zur Minimierung der Infektionsgefahr mit EHEC und zur Bekämpfung der Verbreitung setzt möglichst genaue Kenntnisse über die Wirkungsweise der involvierten Virulenzfaktoren voraus. Aus diesem Grund wurden die Proteine Efa1/LifA und Ent des EHEC RW1374 weiterführend untersucht. In der Proteinsequenz des Efa1/LifA waren Homologien zu verschiedenen Toxinen (ToxB der O157:H7 EHEC, LCT der Clostridien spp., putatives Zytotoxin von Chlamydia caviae) und Adhäsinen (TC0437 von Chlamydia muridarum, YopT von Yersinia spp., PvRBP2 und Rhop von Plasmodium spp., Interaptin von Dictyostelium discoideum) sowie einige Protein-Motive zu finden. Die Expression von Efa1/LifA konnten wir mittels RT-PCR nachweisen. Trotz einiger Probleme bei der Klonierung und Kultivierung ließen sich zwei interne Proteinfragmente (LifA2 und LifA3) fremdexprimieren, aufreinigen und zur Generierung polyklonaler Antikörper verwenden. Während im Immunoblot keine Detektion des Efa1/LifA im Wildstamm nachzuweisen war, konnten wir im Zellkulturverfahren eine spezifische Anfärbung der Bakterienhülle des adhärenten EHEC-Stamms RW1374 mittels Immunfluoreszenz und konfokaler Laserscan Mikroskopie sichtbar machen.
    Der virulenzassoziierte Faktor Ent zeigte Sequenzhomologien zu den Enterotoxinen von enteroinvasiven E. coli (EIEC)/Shigella spp. (ShET-2) sowie Yersinia spp. (SenA) und wurde nur unter Eisenmangel-Bedingungen exprimiert. Eine Fremdexpression des Ent gelang uns nicht, was wir auf eine mögliche Toxizität zurückführten.