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PCR und DNA-Sondenhybridisierung zur Überprüfung des Behandlungserfolges von Trypanosomen-Infektionen bei Rindern in der Provinz Kénédougou in Burkina Faso, Westafrika (2002)

Art

Hochschulschrift

Autor

Gall, Yvonne

Quelle

Berlin, 2002 — 184 Seiten

Verweise

URL (Volltext): http://www.diss.fu-berlin.de/diss/receive/FUDISS_thesis_000000000823

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Institut für Parasitologie und Tropenveterinärmedizin

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parasitologie@vetmed.fu-berlin.de

Abstract / Zusammenfassung

Die durch Tsetsefliegen übertragene Trypanosomose der Nutztiere (Nagana) verursacht in
den afrikanischen Ländern südlich der Sahara erhebliche ökonomische Verluste. Bei der
Bekämpfung dieser Tierseuche steht der Einsatz von Trypanoziden im Vordergrund.
Aufgrund ihres nunmehr über 40-jährigen Einsatzes haben sich Resistenzen gegenüber den
beiden bedeutendsten Wirkstoffen Isometamidiumchlorid (ISMM) und Diminazenazeturat
(DIM) gebildet. Vorkommen und Verbreitung von resistenten Trypanosomenpopulationen
wurden in Rinderherden in der Provinz Kénédougou im Südwesten von Burkina Faso
(Westafrika) mittels parasitologischer Methoden im Rahmen eines durch das BMZ
geförderten Projektes (1998 - 1999) bestimmt.
Ziel der vorliegenden Dissertation war es, die Eignung der Polymerasekettenreaktion (PCR)
zur Überprüfung der prophylaktischen Wirkung von ISMM und des therapeutischen Erfolgs
von DIM zu testen.
Die mit der PCR analysierten Blutproben stammten von Rindern, die im Rahmen der
Blockbehandlungsstudie des BMZ-Projektes untersucht wurden. Eine Gesamtpopulation von
738 Rindern aus 10 Dörfern mit einer erhöhten Trypanosomenprävalenz von über 10%
wurde zu Beginn der Studie mit ISMM (1 mg/kg KGW) behandelt. Erneut parasitologisch
positive Rinder wurden bei den 14-tägig stattfindenden Nachuntersuchungen zusätzlich mit
DIM (3,5 mg/kg KGW) behandelt.
Vor der ISMM-Behandlung wurden parasitologisch mit der sogenannten "Buffy Coat Technik"
(BCT) bei 90 der 738 untersuchten Rinder (12,2%) Trypanosomen diagnostiziert. Mit der
PCR wurden Blutproben der 90 BCT-positiven Rinder und dieselbe Anzahl Blutproben BCT-negativer
Rinder, welche zufällig aus den 648 Blutproben BCT-negativer Rinder ausgewählt
wurden, untersucht. Mit den Primerpaaren für Trypanosoma brucei, T. vivax und
T. congolense savannah wurden in drei Simplex-PCR-Läufen insgesamt 92,2% (83) der 90
parasitologisch positiven Rinder bestätigt. Von den 90 parasitologisch negativen Rindern
reagierten 37,8% (34) positiv.
Vierzehn Tage nach der ISMM-Applikation wurde der prophylaktische Erfolg mit beiden
Methoden überprüft. Dabei wurden wiederum Trypanosomeninfektionen diagnostiziert. Von
den parasitologisch positiven Rindern reagierten 97,1% (34/35) und von den parasitologisch
negativen Rindern reagierten 28,8% (41/142) PCR-positiv. Auch 14 Tage nach einer
zusätzlichen DIM-Therapie von 34 Rindern, die nach der ISMM-Prophylaxe parasitämisch
waren, wurden mit beiden Methoden Trypanosomeninfektionen festgestellt. Dabei waren alle
parasitologisch positiven Rinder (5) sowie 55,2% (16) der parasitologisch negativen Rinder
PCR-positiv.
Während vor der ISMM- Prophylaxe ca. 30% mehr positive Rinder mit der PCR im Vergleich
zur BCT nachgewiesen wurden, waren es nach der ISMM-Prophylaxe 114% bzw. nach der
zusätzlichen DIM-Therapie 320%. Die Zunahme der diagnostischen Differenz zwischen den
beiden Methoden ist sehr wahrscheinlich auf ein häufigeres Unterschreiten der
parasitologischen Nachweisgrenze nach den Trypanozidbehandlungen zurückzuführen. Die
Abtötung der sensiblen Trypanosomenpopulationen führte zu allgemein niedrigeren
Parasitämien, wenngleich resistente Populationen überlebten.
Auf der Ebene der beteiligten Dörfer hatte dieser Unterschied zur Folge, dass mit der BCT im
Gegensatz zur PCR das Auftreten trypanozidresistenter Infektionen mancherorts nicht
erkannt wurde.
Die mit beiden Methoden am häufigsten diagnostizierte Trypanosomenspezies war
T. congolense gefolgt von T. vivax und T. brucei. Vor der ISMM- Prophylaxe wurden mit der
PCR im Vergleich zur BCT insbesondere mehr Infektionen mit T. brucei und mehr
Mischinfektionen identifiziert, die zumeist in Verbindung auftraten. Nach der ISMM-
Prophylaxe wurden wiederum alle Spezies parasitologisch diagnostiziert, während mit der
PCR nur noch T. congolense savannah und T. vivax nachweisbar waren. Die beiden Spezies
waren mit der PCR auch noch nach der DIM-Therapie nachweisbar, wogegen
parasitologisch nur noch T. congolense identifiziert wurde.
Die Identität der PCR-Amplifikate wurde mit spezifischen DNA-Sonden verifiziert. Von den
bei der Elektrophorese negativ beurteilten PCR-Ansätzen erzeugten außerdem bis zu 10,7%
Hybridisierungssignale, wodurch die Sensitivität der PCR noch gesteigert wurde.
Zur Vereinfachung und Kostenreduzierung der Methode wurde eine Multiplex-PCR mit den
drei verwendeten Primerpaaren getestet. Eine wiederholte Analyse von Proben mit
Einfachinfektionen erbrachte dieselben Ergebnisse wie mit der Simplex-PCR. Proben mit
Mischinfektionen wurden hingegen nur etwa zur Hälfte als solche identifiziert, während bei
den übrigen Proben Einfachinfektionen nachgewiesen wurden. Bei manchen Proben
entstand ein unspezifisches DNA-Produkt.
Für einen Einsatz bei Feldstudien müsste die Multiplex-PCR optimiert werden, um die
kompetitive Hemmung der Primerpaare bei Mischinfektionen zu minimieren und die
Entstehung unspezifischer Produkte zu vermeiden.
Die Simplex-PCR wird aufgrund der Untersuchungsergebnisse dieser Arbeit als geeignete
Methode zur Überprüfung des Behandlungserfolges von T. congolense- und
T. vivax-Infektionen bei Rindern unter Feldbedingungen beurteilt. In Verbindung mit der
DNA-Sondenhybridisierung konnte damit die Existenz von Isometamidium- und Diminazen-resistenten
T. congolense- und T. vivax-Populationen bei Rindern in der Provinz
Kénédougou in Burkina Faso bestätigt werden. Bei T. brucei- Infektionen ist die Eignung der
Methode aufgrund der Tendenz dieser Spezies, in das ZNS auszuwandern und sich somit
der Trypanozidwirkung und dem Nachweis im Blut zu entziehen, eingeschränkt.