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Molekulare Charakteristik von adulten Trematoden der Familie Opisthorchiidae mittels PCR und RFLP-Analyse:
mit einem Beitrag zum molekularen Nachweis von Eiern der Arten Opisthorchis felineus (Rivolta, 1884) und Metorchis bilis (Braun, 1790) im Kot von Füchsen (2003)

Art

Hochschulschrift

Autor

Pauly, Andreas Karl (WE 13)

Quelle

Berlin: Mensch-und-Buch-Verl., 2003 — 132 Seiten

ISBN: 3-89820-574-6

Verweise

URL (Volltext): https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/11062

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Abstract / Zusammenfassung

Der wiederholte Nachweis der als Zoonoseerreger geltenden opisthorchiiden Leberegel bei den entsprechenden End- und Zwischenwirten im Gebiet von Berlin-Brandenburg ließ erkennen, dass diese Trematoden auch in Deutschland eine potentielle Gefahr für die einheimische Bevölkerung darstellen. Da eine Differenzierung der Eier verschiedener opisthorchiider Leberegelspezies im Kot der Endwirte mittels Lichtmikroskopie nicht möglich ist, entstand die Idee, den Nachweis und die Unterscheidung der Eier mittels molekularbiologischer Methoden (PCR und RFLP-Analyse) zu führen. Hierfür wurde zunächst ein Verfahren entwickelt, mit welchem adulte Exemplare der verschiedenen Trematodenspezies differenziert werden konnten. Die benötigten adulten Leberegel wurden einerseits aus experimentell infizierten Säugetieren und Vögeln, andererseits aus natürlich infizierten Endwirten isoliert.
Mit Hilfe von Primern, die eine Teilsequenz der mitochondrialen Cytochrom C Oxidase I (COI) in der PCR amplifizieren, konnten Produkte von ca. 440 bp für die untersuchten opisthorchiiden Trematodenarten (O. felineus, C. sinensis, M. bilis, M. xanthosomus, P. truncatum) und ein Produkt von ca. 630 bp für die Spezies O. viverrini gewonnen werden. Auf dieser Ebene war bereits eine Differenzierung der morphologisch nicht unterscheidbaren Exemplare von O. felineus und O. viverrini möglich. Da die eingesetzten COI-Primer aber mit der DNA verschiedener Zestoden der Fleischfresser kreuz reagierten, wurden die Amplifikate
der untersuchten opisthorchiiden Trematodenspezies sequenziert, um anhand der vorliegenden Sequenzen speziesspezifische Primer zu konstruieren, die jeweils nur in der entsprechenden variablen Region der Teilsequenz des COI-Gens binden. Solche spezifischen Primer konnten zunächst für die am häufigsten vorkommenden einheimischen Arten O. felineus und M. bilis synthetisiert werden (OF- und MB-Primer). Diese wurden mit DNA von je 10 O. felineus und 10 M. bilis, die aus verschiedenen Endwirten isoliert worden waren, sowie mit DNA von P. truncatum, von Zestoden und mit DNA der Zwischenwirtsspezies getestet. Außerdem erfolgte die Überprüfung der analytischen Sensitivität durch Verdünnung von 20 ng DNA je eines O. felineus- und M. bilis-Isolats bis zu einem Gehalt von 1 fg. Bei den durchgeführten Versuchen ergab sich eine Spezifität von 100% für OF- und MB-Primer. Die Nachweisgrenze für O. felineus-DNA lag bei 10 pg, die für M. bilis-DNA bei 100 fg. Durch Einsatz von OF- und MB-Primern war es außerdem möglich, DNA opisthorchiider Trematodeneier im Kot experimentell infizierter Silberfüchse nachzuweisen und zu differenzieren. Die hierbei aufgetretenen Probleme werden in der vorliegenden Arbeit diskutiert.
Als weitere Methode der molekularen Differenzierung diente die RFLP-Analyse von COI-Amplifikaten der Spezies O. felineus, O. viverrini, C. sinensis, M. bilis und P. truncatum unter Verwendung der Endonukleasen Alu I und Hha I. Dabei konnte bereits durch den alleinigen Einsatz von Alu I eine Unterscheidung der oben angeführten Arten erreicht werden.

Insgesamt kann festgehalten werden, dass die in den eigenen Untersuchungen etablierte PCR und RFLP-Analyse zur molekularen Differenzierung von opisthorchiiden Leberegeln herangezogen werden kann. Die verwendeten Methoden können als Grundlage für weiterführende Studien dienen, z.B. für den Nachweis und die Differenzierung opisthorchiider Metazerkarien im Fischgewebe oder parthenogenetischer Stadien opisthorchiider Trematoden in Zwischenwirtsschnecken.