Fachbereich Veterinärmedizin


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    Anwendung von rRNA-Oligonukleotidsonden zum Nachweis nutritiver Einflüsse auf bakterielle Stoffwechselaktivitäten im Verdauungstrakt von Broilern (2002)

    Art
    Hochschulschrift
    Autor
    Loh, Gunnar
    Quelle
    Berlin: Mensch & Buch Verl., 2002 — 133 Seiten
    ISBN: 3-89820-488-X
    Verweise
    URL (Volltext): http://www.diss.fu-berlin.de/diss/receive/FUDISS_thesis_000000001033
    Kontakt
    Institut für Tierernährung

    Königin-Luise-Str. 49
    Gebäude 8
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    +49 30 838 52256
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    Abstract / Zusammenfassung

    Der Einsatz Nicht-Stärke-Polysaccharide (NSP)-hydrolysierender Enzyme gehört seit langer Zeit zur Praxis in der Broilermast. Obwohl eine ganze Kaskade von antinutritiven Effekten der löslichen Nicht-Stärke-Polysaccharide Gegenstand umfangreicher Untersuchungen war und ist, bleibt für einige Aspekte noch immer ein hoher Aufklärungsbedarf. Insbesondere auf die Rolle veränderter mikrobieller Populationen im Verdauungstrakt wird immer wieder verwiesen, ohne dass diese umfassend bekannt ist. Die vorliegende Arbeit sollte einen Beitrag zum Verständnis von Einflüssen unterschiedlich gestalteter Diäten und einer Xylanase auf mikrobielle Gemeinschaften im Verdauungstrakt von Broilern leisten. Es wurde ein Tierversuch durchgeführt, bei dem durch unterschiedlichen Gehalt der Versuchsdiäten an löslichen NSP und durch den Einsatz eines Xylanasepräparates Veränderungen mikrobieller Gemeinschaften im vorderen Verdauungstrakt provoziert wurden. Es kamen eine auf Mais und Soja basierende Diät mit geringem Gehalt an löslichen NSP und zwei Diäten mit Weizen und Roggen als Hauptkomponenten, welche einen hohen Gehalt an löslichen NSP aufwiesen, zum Einsatz. Eine der beiden Weizen-Roggen-Diäten war mit einer Xylanase ergänzt worden. Alle Diäten enthielten Talg als Fettquelle und waren nahezu isoenergetisch und isonitrogen gestaltet.
    Im Rahmen dieses Versuches wurden die zootechnischen Leistungen der Versuchstiere erfasst. Am 7., 14., 21. und 28. Lebenstag wurden Versuchstiere geschlachtet und Digesta aus den Darmabschnitten Duodenum, Jejunum, vorderes und hinteres Ileum, sowie den Caeca gewonnen. Die Proben aus Duodenum, Jejunum, vorderem und hinterem Ileum vom 14., 21. und 28. Lebenstag der Tiere wurden zur Bestimmung intestinaler Enzymaktivitäten verwendet. Für molekularbiologische Untersuchungen wurden die Proben aus Jejunum, vorderem und hinterem Ileum verwendet. Durch Zentrifugation der Proben wurden Überstände gewonnen und damit Agardiffusionsassays zur Bestimmung verschiedener Enzymaktivitäten durchgeführt. Zur molekularbiologischen Untersuchung von RNA-Extrakten aus den Digestaproben musste die Spezifität und Sensitivität von Digoxygenin-markierten Oligonukleotidsonden, welche teilweise der Literatur entnommen und teilweise am Institut für Tierernährung der FU Berlin entwickelt worden waren, überprüft werden. Dabei wurden mögliche Abhängigkeiten der Signalstärken von der jeweils eingesetzten RNA-Menge geprüft. Nur Sonden mit reproduzierbar spezifischen Ergebnissen wurden in weiteren Untersuchungen eingesetzt. Die Gewinnung der Nukleinsäuren aus den Digestaproben erfolgte mittels modifizierter Phenol:Chloroform-Extraktion. Die Rohextrakte wurden säulenchromatographisch in DNA und RNA aufgetrennt und gereinigt. Durch Hybridisierung der aus den Proben extrahierten Gesamt-RNA mit 16S und 23S rRNA Oligonukleotidsonden wurde die Menge ribosomaler RNA ausgewählter Bakteriengruppen und -arten in den Extrakten bestimmt. Sofern möglich, wurde eine Umrechnung der jeweiligen Lichtintensitäten in ng spezifische RNA je µg Gesamt-RNA vorgenommen. Zur Auswertung der Ergebnisse wurde das arithmetische Mittel und die Standardabweichung der parallel angelegten Proben berechnet. Zur statistischen Bewertung wurden die Daten aus den einzelnen Darmabschnitten über den gesamten Versuchszeitraum zu einer Datengrundlage zusammengefasst.
    Die zootechnischen Leistungen der Versuchstiere lassen die in der Literatur gut belegten antinutritiven Effekte von Getreidesorten mit stark viskositätsbildenden Eigenschaften erkennen.
    Mittels Agardiffusionsassays wurden die Aktivitäten der Enzyme zum Abbau von NSP (Xylanase- und 1,3-1,4-β-Glucanaseaktivitäten) bestimmt. Es zeigte sich, dass durch die höhere Konzentration löslicher NSP in der Diät vor allem solche Mikroorganismen gefördert wurden, zu deren Enzymausstattung β-Glucanasen gehören. Die partielle Hydrolyse der Pentosane durch die zugesetzte Xylanase führte zu einer zusätzlichen Förderung solcher Bakterien. Ein stimulierender Einfluss von löslichen NSP und/oder der Xylanase auf xylanspaltende Mikroorganismen konnte in der vorliegenden Untersuchung nicht festgestellt werden. Ebenfalls durch Agardiffusionsassays sollte Hinweisen aus der Literatur auf eine schlechtere Verdauung der Fette bei Diäten mit hohen Gehalten an löslichen NSP nachgegangen werden. Die Ergebnisse der vergleichenden Messung der Gallensäurehydrolase- und Lipaseaktivität in diesem Versuch lassen jedoch eindeutige Relationen zwischen den Aktivitäten dieser Enzyme und der in der Literatur gut belegten schlechteren Verwertung der Nahrungsfette nicht zu. Bei den Lipaseaktivitäten wurden höhere Aktivitäten in der Gruppe mit pentosanarmer Diät erwartet. Der Umstand, dass bei den Gruppen mit pentosanreicher Diät höhere Aktivitäten gemessen wurden, könnte auf eine kompensatorische Regulation und so auf negative Einflüsse löslicher NSP auf die Fettverdauung hindeuten. Höhere Aktivitäten im Duodenum bei der Enzymgruppe gegenüber der Weizen-Roggen-Gruppe weisen auf eine bessere Durchmischung der Digesta mit Verdauungsenzymen hin. Die in der Literatur beschriebene Erhöhung mikrobieller Gallensäurehydrolaseaktivitäten bei hochviskösen Diäten konnte nicht beobachtet werden. Es wurde versucht, die mikrobiellen Gemeinschaften im Verdauungstrakt mittels Hybridisierung der aus Digestaproben der Versuchstiere gewonnenen Gesamt-RNA mit spezifischen Oligonukleotidsonden auf der Ebene von Bakteriengruppen und -arten zu charakterisieren. Die Überprüfung von Oligonukleotidsonden, welche der Literatur entnommen oder am Institut für Tierernährung der FU Berlin entwickelt wurden, hinsichtlich ihrer Spezifität zeigte, dass für gruppenspezifische Oligonukleotidsonden durchweg spezifische Hybridisierungsbedingungen zu schaffen waren. Entsprechend konnten die Oligonukleotidsonden S-D-Bact-0338-a-A-18 (bakterielle 16S rRNA), S-G-Bact-0303-a-A-17 (Bacteroides-Pretovella-Cluster), S-*-Chis-0150-a-A-23 (Clostridium histolyticum-Gruppe), 16E1 (E.coli und Shigella spp.), S-G-Enc-038-a-A-18 (Enterococcus spp.), S-F-Lact-0770-a-A-24 (Lactobacillus spp.) und S-G-Bif-1432-a-A-21 (Bifidobacterium spp.) zu Untersuchungen der RNA-Extrakte eingesetzt werden. Unter den am Institut für Tierernährung entwickelten Oligonukleotidsonden zum Nachweis von Vertretern der Enterococcus spp. konnten lediglich für S-S-Ecaec-0181-a-A-24 (E.caecorum), S-S-Efaes-1237-b-A-17 und S-S-Efeas-203-a-A-20 (E.faecalis, detektierten auch E.faecium), sowie S-S-casflaga-0185-a-A-21 (E.casseliflavus, E.flavescens, E.gallinarum, war nur für E.gallinarum spezifisch) spezifische Hybridisierungsbedingungen ermittelt werden. Sondenkanditaten zum Nachweis von E.asini, E.avium/E.raffinosus, E.columbae, E.faecium und E.hirae konnten wegen mangelnder Spezifität nicht zur Untersuchung der ENA-Extrakte eingesetzt werden. 23S rRNA-Oligonukleotidsonden zum Nachweis von E.faecium (DB6), E.avium, E.malodoratus, E.pseudoavium und E.raffinosus (DB9), von E.durans und E.hirae (Eduhi9b), sowie von E.gallinarum (Ega9b) zeigten bei Untersuchungen zur Spezifität keinerlei Signale. Die zum Nachweis von Vertretern der Lactobacillus spp. eingesetzten Oligonukleotidsonden S-S-Lacet-0061-a-A-25 (L.acetolerans), S-S-Lacid-2519-a-A-20 (L.acidophilus), S-S-Lamy-0499-a-A-24 (L.amylophilus), S-S-Lfer-061-a-A-26 (L.fermentum), S-S-Lgas-0054-a-A-24 (L.gasseri) und S-S-Lreu-0485-a-A-23 (L.reuteri) waren bereits erfolgreich in vorangegangenen Untersuchungen am Institut für Tierernährung der FU Berlin eingesetzt worden. Bei fast allen Oligonukleotidsonden konnte durch Auftrag der jeweiligen Lichtintensitäten gegen die Mengen der eingesetzten Gesamt-RNA ein Bereich linearer Abhängigkeit dieser beiden Parameter ermittelt werden. Dieser Umstand ermöglichte eine Umrechnung von Signalstärken in den Gehalt der Proben an spezifischer 16S bzw. 23S rRNA/µg Gesamt-RNA. Bei der Hybridisierung der RNA-Extrakte wies S-S-Lfer-061-a-A-26 eine exponentielle Beziehung zwischen RNA-Menge und Signalstärke auf. Bei Einsatz der Oligonukleotidsonde (16E1) war keine Abhängigkeit zu beobachten. Die Einordnung der Ergebnisse der Hybridisierungen in die in der Literatur veröffentlichten Erkenntnisse erwies sich als schwierig, da eindeutige Angaben über den Gehalt einzelner Bakterienzellen an ribosomaler RNA in Masseeinheiten bislang fehlen und Literaturangaben zu mikrobiellen Gemeinschaften im Verdauungstrakt von Broilern durch Kultivierung erzeugt wurden. Vergleiche mit solchen Untersuchungen können folglich nur unter Vorbehalten durchgeführt werden. Der Einsatz von Diäten, welche bezüglich ihres Gehaltes an löslichen NSP unterschiedlich gestaltet waren, und der Einsatz einer Xylanase führte zu unterschiedlichen Mengen von ribosomaler RNA der ausgewählten Bakteriengruppen und -arten in den Proben. Während die bakteriellen Gesamtstoffwechselaktivitäten und die Aktivitäten von Enterobakterien und Enterokokken bei der Weizen-Roggen-Diät im Vergleich zur Maisgruppe nach distal verschoben wurden, konnte insgesamt eine Verringerung der Aktivitäten von Laktobazillen beobachtet werden. Der Xylanasezusatz führt zu einer Senkung der Stoffwechselaktivitäten von Enterobakterien gegenüber der nicht supplementierten Gruppe, die Aktivitäten von Laktobazillen stiegen an. Eine Verschiebung der bakteriellen Gesamtaktivitäten gegenüber der Mais-Diät nach distal ist geringer ausgeprägt. Die Untersuchung ausgewählter Arten der Enterokokken und Laktobazillen zeigten, dass qualitative Änderungen innerhalb von Bakteriengruppen bei unterschiedlich gestalteten Diäten stattfinden. So werden vermutlich Enterokokken und Laktobazillen mit der Fähigkeit zum Abbau von β-Glucanen gefördert, wenn NSP in der Diät vermehrt enthalten sind. Der Zusatz einer Xylanase könnte diese Mikroorganismen zusätzlich fördern. Andere Vertreter dieser Bakteriengruppen scheinen durch einen hohen NSP-Gehalt der Diät im Wachstum gehemmt zu werden. Hier kann der Zusatz einer Xylanase zu einer weiteren Hemmung führen.
    Weiterführende Untersuchungen zur Diversität der mikrobiellen Gemeinschaften im Verdauungstrakt von Broilern und deren Charakterisierung sind wünschenswert.