Fachbereich Veterinärmedizin


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    Multiplex-Polymerase-Ketten-Reaktion (MPCR) zum Nachweis ausgewählter Virulenzfaktoren schweinepathogener Escherichia coli - Einsatz bei Ferkeln mit Bacillus cereus var toyoi Zulage - (2003)

    Art
    Hochschulschrift
    Autor
    Göbel, Sandra
    Quelle
    Berlin: Mensch & Buch Verl., 2003 — 138 Seiten
    ISBN: 3-89820-583-5
    Verweise
    URL (Volltext): http://www.diss.fu-berlin.de/diss/receive/FUDISS_thesis_000000001112
    Kontakt
    Institut für Tierernährung

    Königin-Luise-Str. 49
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    Tel.+49 30 838 52256 Fax.+49 30 838-55938
    email:tierernaehrung@vetmed.fu-berlin.de

    Abstract / Zusammenfassung

    In dieser Untersuchung wird die Validierung und Anwendung eines molekularbiologischen Nachweises von insgesamt neun Virulenzfaktoren schweinepathogener E. coli dargestellt. Dabei sollten die Gene für StaP (est-Ib), Stb (est-II), LT (elt-Ia), Stx2e (stx2e), F4 (fae), F5 (fan), F6 (fas), F18ab (fedA) und F41 (fimf41a) mittels einer Multiplex PCR (MPCR) und nachfolgender Hybridisierung mit internen Oligonukleotidsonden sowohl in E. coli Isolaten als auch in aus Darmmucosa von Ferkeln extrahierter DNA qualitativ nachgewiesen werden. Die Methode diente der Untersuchung von Darmproben eines an schwerer Diarrhoe erkrankten Absetzferkels, von Kotproben klinisch gesunder Ferkel und Sauen aus den institutseigenen Stallanlagen, sowie von Darmproben von Ferkeln nach Einsatz von B. cereus var. toyoi als probiotischen Futterzusatzstoff im Vergleich zu einer Kontrollgruppe.

    Die angewandte Methode zur simultanen DNA- und RNA-Gewinnung aus mucosalen Proben ermöglicht trotz der großen Anzahl an Arbeitsschritten und der damit verbunden Fehlerquellen die Extraktion einer zur Diagnostik ausreichenden Menge Nukleinsäuren aus gramnegativen Bakterien mit der zum Einsatz in der PCR notwendigen Qualtität. Die MPCR wurde zunächst an der DNA von E. coli Isolaten validiert und im Laufe der Untersuchung bei mucosalen DNA-Extrakten eingesetzt. Sie stellte sich insbesondere beim Einsatz von Isolaten als schnelles und sensitives System zum genetischen Nachweis ausgewählter Virulenzfaktoren pathogener E. coli dar. Nachteilig ist jedoch die notwendige Optimierung, die ein hohes Maß an Zeitaufwand erfordert. Der Nachweis des Gens für F4 (fae) in den mucosalen DNA-Extrakten gelang mittels der MPCR jedoch nicht eindeutig. Eine PCR zum alleinigen Nachweis von fae konnte in relativ kurzer Zeit optimiert werden, wobei der Einsatz mucosaler DNA-Extrakte sporadisch zur Bildung unspezifischer Produkte führte. Bei der Hybridisierung mit mucosalen DNA-Extrakten nach der MPCR erwiesen sich acht der neun eingesetzten Oligonukleotidsonden als spezifisch und sensitiv. Die Sonde für fae lieferte nur bei Einsatz von DNA aus Isolaten nach der MPCR spezifische Signale. Der sichere Einsatz bei den mucosalen DNA-Extrakten konnte nicht erreicht werden.
    Sieben Tage nach dem Absetzen wurden Mucosaproben eines an Durchfall erkrankten Ferkels mittels MPCR untersucht. Dabei ergaben sich Hinweise auf eine Kolonisierung des Ferkeldarms mit ETEC und STEC Stämmen. Bei in den Versuchsanlagen gesammelten Kotproben von Sauen und Ferkeln wiesen ein hoher Prozentsatz der gewonnen und mittels MPCR untersuchten Isolate E. coli Pathogenitätsfaktoren auf. Bei den Absetzferkeln fiel der Anteil der fedA positiven Isolate hoch aus. Zwei Isolate zeigten neben fedA auch das Vorhandensein von stx2e und est-II. Sie sind möglicherweise in der Lage, sowohl die Colidiarrhoe als auch die Ödemkrankheit auszulösen und könnten eventuell im Sinne eines Erregerreservoirs in Zusammenhang mit der Durchfallerkrankung des oben genannten Absetzferkels stehen. Zwanzig Prozent der Isolate reagierten in der PCR hinsichtlich fae mit einem positiven Ergebnis. Est-II war das am häufigsten mittels der PCR nachgewiesene Toxin und war besonders oft mit fae assoziiert.

    In einem Fütterungsversuch erhielten Ferkel B. cereus var. toyoi als Futterzusatzstoff. Diese zeigten im Vergleich zu einer Kontrollgruppe tendenziell, insbesondere aber in den Altersstufen nach erstmalig erfolgter Beifuttergabe (21. und 28. Lebenstag), eine geringere Anzahl Proben, in denen mittels MPCR E. coli Pathogenitätsfaktoren nachgewiesen wurden. Ein Trend, der sich durch alle Altersgruppen verfolgen lässt, ist das verminderte Auftreten elt-Ia tragender E. coli in der Versuchsgruppe. Im Alter von 32 Tagen scheint die Anzahl an Pathogenitätsfaktoren in der Versuchsgruppe im Vergleich zu den Kontrolltieren zugenommen zu haben. Bei keinem Tier dieser Altersstufe trat Durchfall auf. In Verbindung mit Ergebnissen anderer Studien, die bei Bacillus cereus var. toyoi Zulage auf eine signifikante zelluläre und humorale Immunstimulation hinweisen, könnte dieses Phänomen aus immunologischer Sicht möglicherweise als eine spezifische Antigenstimulanz des Immunsystems des Wirtstieres interpretiert werden. Darüber hinaus besteht unter Einbeziehung anderer Untersuchungen die Möglichkeit, dass über eine höhere Dichtigkeit der parazellulären Barriere im Darm eine begleitende Hemmung der Invasion pathogener E. coli in die Darmschleimhaut stattfindet und so das Krankheitsbild unterdrückt wird. Trotz der in der Literatur vielfach beschriebenen Senkung der E. coli-Keimzahlen im Darm von probiotisch versorgten Ferkeln wurde in diesem Versuch keine nennenswerte Reduktion des Auftretens von Pathogenitätsfaktoren beobachtet.