Fachbereich Veterinärmedizin


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    Versuche zur Gewinnung muriner monoklonaler Antikörper zum Tierartennachweis in Lebensmitteln unter Verwendung verschiedener Immunisierungs-Antigenaufbereitungen (2003)

    Art
    Hochschulschrift
    Autor
    Buchholz, Matthias
    Quelle
    Berlin, 2003 — 121 Seiten
    Verweise
    URL (Volltext): http://www.diss.fu-berlin.de/diss/receive/FUDISS_thesis_000000000946
    Kontakt
    Institut für Lebensmittelsicherheit und -hygiene

    Königsweg 69
    14163 Berlin
    Tel.+49 30 838 62550 Fax.+49 30 838 46029
    email:lebensmittelhygiene@vetmed.fu-berlin.de

    Abstract / Zusammenfassung

    In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, anhand verschiedener Antigenauf-bereitungsmethoden zur Immunisierung von Mäusen speziesspezifische monoklonale Antikörper zum Tierartennachweis von Fleisch in erhitzten Lebensmitteln zu gewinnen. Die eigenen Untersuchungen wurden modellhaft an Extrakten von erhitzter Muskulatur der Tierarten Rind und Schwein durchgeführt.
    Die gezielte Anreicherung und Reinigung eines Antigens zur Immunisierung war nicht möglich, da es bisher nur unzureichende Kenntnisse über speziesspezifische und hitzestabile Antigene in Extrakten aus erhitzter Muskulatur gibt. Die Ergebnisse anderer Untersucher deuten sowohl auf die Existenz von hitzestabilen spezifischen Antigenen, die bereits im Rohmaterial enthalten sind, als auch auf spezifische Antigene, die erst durch den Erhitzungsprozeß entstehen, hin.
    Aus diesen Gründen wurden die folgenden Antigenaufbereitungsmethoden ausgewählt, die sich in der Stärke der thermischen Belastung des Muskelfleisches und der Extraktionsmethode unterschieden:
    1. Antigenaufbereitung 1 (Lyophilisat)
    Zerkleinerte Muskulatur wurde für 15 Minuten auf 56 °C Kerntemperatur erhitzt, anschließend lyophilisiert und 500 mg Lyophilisat mit physiologischer Kochsalzlösung für 18 Stunden extrahiert. Die Immunisierungslösung enthielt 0,4 mg Protein je Dosis.
    2. Antigenaufbereitung 2 (nach RAVESTEIN u. DRIEDONKS, 1986)
    5 g zerkleinerte Muskulatur wurden in 10 ml PBS-Puffer für 5 Minuten im 100 °C Erkalten wurde das Präparat zentrifugiert und filtriert. Auch hier enthielt die Immunisierungslösung 0,4 mg Protein je Dosis Wasserbad erhitzt. Dabei wurden Kerntemperaturen von ca. 89 °C erreicht. Nach dem
    3. Antigenaufbereitung 3 (nach HITCHCOCK et al., 1981)
    50 g zerkleinerte Muskulatur wurden im Autoklaven für 15 Minuten auf 110 °C erhitzt und anschließend zu einem Aceton-Trocken-Pulver verarbeitet. Die Extraktion erfolgte mit einer Harnstoff-Mercaptoethanollösung für eine Stunde im 100 °C Wasserbad.
    4. Antigenaufbereitung 4 (Ultrafiltration)
    Die zerkleinerte Muskulatur wurde für 30 Minuten bei einer Kerntemperatur von ca.
    98 °C erhitzt und anschließend mit Aqua dest. 24 Stunden bei 4 °C extrahiert. Nach der Zentrifugation und Filtration wurde der Extrakt nacheinander über Flachmembranfilter mit unterschiedlichen Molekulargewichts-Trennbereichen filtriert. Aufgrund eigener Voruntersuchungen und von Literaturhinweisen wurden die hochmolekularen Konzentrate ( 300 kDa und 100 ý 300 kDa) zur Immunisierung der Mäuse eingesetzt.

    Aus der Antigenaufbereitung 1 gingen zahlreiche spezifisch reagierende Antikörper verschiedener Hybridome hervor. Ein Klon konnte etabliert werden. Bei den weiteren Untersuchungen stellte sich heraus, dass dieser monoklonale Antikörper nur mit dem Immunisierungsantigen spezifisch reagierte. Das Antigen war nicht hitzestabil. Eine Erhitzung auf 60 °C reichte bereits aus, das Antigen soweit zu denaturieren, dass es nicht mehr mit dem monoklonalen Antikörper reagierte.
    Auch mit der Antigenaufbereitung 2 konnten einige mit dem homologen Antigen spezifisch reagierende Hybridomantikörper nachgewiesen werden. Diese zeigten jedoch keine spezifischen Reaktionen mit den stärker denaturierten Antigenen aus der Antigen-aufbereitung 3. Ein Klon konnte nicht etabliert werden.
    Aus der Antigenaufbereitung 3 gingen überraschenderweise keine spezifisch reagierenden Hybridomantikörper hervor. Andere Experimentatoren erzielten gerade mit der Harnstoff-extraktion bei stark hitzedenaturierten Proben unter Einsatz polyklonaler Antiseren gute Ergebnisse.
    Am erfolgreichsten stellte sich die Antigenaufbereitung 4 heraus. Obwohl das Antigenmaterial auch einer starken Hitzedenaturierung unterlag, wurden zahlreiche hochspezifische Antikörper verschiedener Hybridome nachgewiesen. Durch die Ultra-filtration konnten die hochmolekularen Proteine angereichert und von niedermolekularen Eiweißen getrennt werden. Diese scheinen vor allem für unspezifische Reaktionen auch in anderen Untersuchungssystemen verantwortlich zu sein. Bei den hochmolekularen spezifisch reagierenden Antigenen handelt es sich wahrscheinlich um Proteinaggregate, die erst durch den Erhitzungsprozeß entstehen, und nicht um hitzestabile Antigene, die bereits im Rohmaterial vorhanden sind. Diese Annahme wird auch dadurch bestätigt, dass für den kommerziellen ELISA die Anwendungsvorschrift für rohe oder gering erhitzte Proben eine Nacherhitzung für 15 Minuten im 100 °C Wasserbad vorschreibt.

    Bei den eigenen Untersuchungen stellte sich die Zellkultivierung und hier vor allem das Etablieren von stabilen, antikörperbildenden Klonen als besondere Schwierigkeit heraus, so konnten weitergehende Untersuchungen oft nicht mehr durchgeführt werden.
    Mit der IEF, dem kommerziellen ELISA und der PCR bzw. DNA-Sonden-Technik stehen gute Instrumente für die Lebensmittelüberwachung zur Tierartbestimmung auch in erhitzten Lebensmitteln zur Verfügung. Bei differenzierteren Fragestellungen oder durch neue gesetzliche Bestimmungen kann es erforderlich sein, auch gewebe- und tierartspezifische Antikörper für entsprechende Untersuchungen zur Verfügung zu haben. Die Gewinnung monoklonaler Antikörper unter Verwendung entsprechend gereinigter Antigene scheint dafür ein erfolgversprechender Weg zu sein.