Fachbereich Veterinärmedizin


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    Induktion, Präparation und Charakterisierung von Dotterantikörpern gegen Östrogene (2003)

    Art
    Hochschulschrift
    Autor
    Beike, Sonja
    Quelle
    Berlin, 2003 — 132 Seiten
    Kontakt
    Institut für Tier- und Umwelthygiene

    Robert-von-Ostertag-Str. 7-13
    Gebäude 35
    14169 Berlin
    Tel.+49 30 8385 1845 Fax.+49 30 83845 1863
    email:tierhygiene@vetmed.fu-berlin.de

    Abstract / Zusammenfassung

    In recent years, the use of avian, vitelline antibodies (IgY) has gained ever increasing impor-tance. Up until now, IgY has not been used in the diagnostic of estrogens. The aim of the work presented here was the induction, preparation and characterisation of yolk antibodies against estrogens. For the induction of yolk antibodies against estrogens, chickens were immunised with new prepared antigens (17a-estradiol, 17ß-estradiol and estrone) which were coupled to Keyhole Limped Hemocyanin (KLH). The antibodies were isolated from the egg yolk using various methods of purification (ammo-nium sulfate precipitation, fat removal using chloroform, polyethylenglycol precipitation, chloroform-polyethylenglycol-method, batch method, affinity chromatography, thiophile ad-sorption chromatography). So that a comparison could be made, the purity of the antibody preparations obtained was displayed with the aid of SDS-PAGE. From the point of view of expenditure and yield, ammonium sulphate precipitation is particulary suitable for obtaining antibodies from egg yolk. For the use of the antibody obtained in enzyme immunoassay, a screening est was developed, in order, amongst other things, to demonstrate that the antibody developed reacts specifically to the estrogens used for immunisation. For this purpose, BSA-coupled strogens were used as antigens for this purpose. For the screeningtest, suitable antigen or antibody dilutions were tested out. In addition, an assessment was made of various microtitration plates, incubation times and blocking substances. The result of these investigations was that the following implementation of the screening test was particularly suitable: microtitration plates made by the company Nunc (immuno-plate F96, maxisorp) were coated with estrogen-BSA-conjugates (10 µg/ml); this coating was blocked with BSA (3 %) and he yolk antibodies were used in a concentration of 1/100. The incubation period for the antibodies was 1 hour. The specificity of the antibody obtained could be clearly demonstrated with this screeningtest. The testing of the course of the antibody reactivity was carried out using this screeningtest during the immunisation period. In contrast to the course of general antibody reactivity, the course of the specific antibody reactivity can be considered to be a response to immunisation. In addition, the cross-reactivity of the manufactured antibodies was tested with different anti-gens (17a-estradiol-BSA-conjugate, 17ß-estradiol-BSA-conjugate, estrone-BSA-conjugate) using the screeningtest which was developed. Both the manufactured Yolk antibodies, as well as also manufactured rabbit antibodies showed a high level of cross-reactivity. For this reason, they are only suitable for determining the total estrogen content. With aid of the indirect competetive enzyme immunoassay which was developed, it was pos-sible to demonstrate that the manufactured yolk antibodies are able to both recognise and bind to microtitration-plate-bound estrogens, as well as also estrogens located freely in the solu-tion. It was possible to demonstrate estrogen concentrations of 92 to 1,15 mg/ml in the solu-tion. Investigations of the stability of yolk antibodies indicated that the yolk antibodies could be repeatedly frozen at -20 °C and thawed out again without any loss of their reactivity, as well as stored at least 5 weeks at +4 °C, 3 weeks at +20 °C and 1 week at +37 °C. The results of this study show that a constribution has been made to the use of avian vitelline antibodies against estrogens in hormone diagnostics. They should be considered to be the ba-sis for the development of a commercial test system. In addition, it should be emphasised that, for antibody production, a non-invasive method for obtaining antibodies against estrogens and therefore one of relevance to the protection of animals has been presented. Deutsch: In den letzten Jahren hat der Einsatz von aviären vitellinen Antikörpern (IgY) immer mehr an Bedeutung gewonnen. Bisher fanden die IgY in der Diagnostik von Östrogenen noch keine Verwendung. Aufgabe dieser Arbeit war die Induktion, Präparation und Charakterisierung von Dotterantikörpern gegen Östrogene. Für die Induktion von Dotterantikörpern gegen Östrogene wurden Hühner mit neu hergestellten Antigenen (17a-Östradiol, 17ß-Östradiol und Östron) immunisiert, die an Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) gekoppelt waren. Die Antikörper wurden mit verschiedenen Reinigungsmethoden (Ammoniumsulfatfällung, Entfettung mittels Chloroform, Polyethylenglycolfällung, Chloroform-Polyethylenglycol-Methode, Batch-Verfahren, Affinitätschromatographie, thiophile Adsorptionschromatographie) aus den Eidottern isoliert. Vergleichend wurde die Reinheit der gewonnenen Antikörperpräparationen mit Hilfe der SDS-PAGE dargestellt. Nach den Gesichtspunkten Aufwand und Nutzen ist die Ammoniumsulfatfällung für die Antikörpergewinnung aus dem Eidotter besonders geeignet. Für den Einsatz der gewonnenen Antikörper im Enzymimmunoassay wurde ein Screeningtest entwickelt, um unter anderem zu zeigen, dass die entwickelten Antikörper spezifisch auf die zur Immunisierung verwendeten Östrogene reagieren. Hierfür wurden als Antigene an BSA-gekoppelte Östrogene verwendet. Für den Screeningtest wurden die geeigneten Antigen-, bzw. Antikörperverdünnungen ausgetestet. Außerdem erfolgte die Prüfung verschiedener Mikrotitrationsplatten, Inkubationszeiten und Blockierungssubstanzen. Als Ergebnis dieser Untersuchungen erwies sich folgende Durchführung des Screeningtest als besonders geeignet: Mikrotitrationsplatten der Firma Nunc (immunoplate F 96, Maxisorp) wurden mit den Östrogen-BSA-Konjugaten (10 µg/ml) beschichtet; diese Beschichtung wurde mit BSA (3 %) blockiert; die Dotterantikörper wurden in einer Konzentration von 1/100 eingesetzt; die Inkubationszeit für die Antikörper betrug 1 Stunde. Die Spezifität der gewonnenen Antikörper konnte mit diesem Screeningtest eindeutig nachgewiesen werden. Mit diesem Screeningtest erfolgte die Testung des Verlaufs der Antikörperreaktivität während des Immunisierungszeitraumes. Im Gegensatz zu dem Verlauf der allgemeinen Antikörperreaktivität war der Verlauf der spezifischen Antikörperreaktivität als Antwort auf die Immunisierung zu sehen. Mit dem entwickelten Screeningtest wurde außerdem die Kreuzreaktivität der hergestellten Antikörper mit unterschiedlichen Antigenen (17a-Östradiol-BSA-Konjugat, 17ß-Östradiol-BSA-Konjugat, Östron-BSA-Konjugat) getestet. Sowohl die hergestellten Dotterantikörper, als auch die hergestellten Kaninchenantikörper wiesen eine hohe Kreuzreaktivität auf. Aus diesem Grunde sind sie nur für die Bestimmung des Gesamtöstrogengehalts geeignet. Mit Hilfe eines entwickelten indirekten kompetitiven Enzymimmunoassays konnte gezeigt werden, dass die hergestellten Dotterantikörper in der Lage sind, sowohl an die Mikrotitrationsplatte gebundene Östrogene, als auch sich frei in Lösung befindliche Östrogene zu erkennen und zu binden. Es gelang, in Lösung befindliche Östrogenkonzentrationen von 9,2 bis 1,15 mg/ml nachzuweisen. Die Untersuchungen zur Stabilität der Dotterantikörper ergaben, dass die Dotterantikörper ohne Verlust ihrer Reaktivität wiederholt bei -20 °C eingefroren und wieder aufgetaut, sowie mindestens 5 Wochen bei +4 °C, 3 Wochen bei +20 °C und 1 Woche bei +37 °C gelagert werden können. Mit den Ergebnissen dieser Arbeit ist ein Beitrag für den Einsatz von aviären vitellinen Antikörpern gegen Östrogene in der Hormondiagnostik geleistet worden. Sie sind als Grundlage für die Entwicklung eines kommerziellen Testsystems anzusehen. Außerdem ist hervorzuheben, dass zur Antikörperproduktion eine nicht invasive und damit tierschutzrelevante Methode zur Gewinnung von Antikörpern gegen Östrogene vorgestellt wurde.