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Untersuchung der Funktion der Palmitoylierung von SNAP-25 (2003)

Art

Hochschulschrift

Autor

Kammer, Bettina

Quelle

— 120 Seiten

Verweise

URL (Volltext): http://www.diss.fu-berlin.de/diss/receive/FUDISS_thesis_000000003801

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Abstract / Zusammenfassung

Die synaptosomalen SNARE-Proteine VAMP2, Syntaxin1 und SNAP-25 bilden einen SNARE-Komplex, der die Fusion synaptischer Vesikel mit der präsynaptischen Plasmamembran auslöst. Die Bildung und die enzymatische Spaltung des SNARE-Komplexes wurden weitestgehend mit rekombinanten, aus E.coli gereinigten Proteinen untersucht. Jedoch fehlen diesen Proteinen die Proteinmodifikationen, die für eukaryotische Zellen beschrieben sind. Eine wichtige Modifikation der SNARE-Proteine ist die kovalente Bindung von Fettsäuren an SNAP-25. Palmitoylierung findet in einem Kluster von vier Cysteinen statt und ist vermutlich der Anker des intrinsisch hydrophilen Proteins mit der präsynaptischen Plasmamembran. In der vorliegenden Arbeit sind SNAP-25 Wildtyp und Mutanten mit sowohl Substitutionen gegen Serin oder Alanin als auch einer Deletion über einen Bereich von 13 Aminosäuren in der Palmitoylierungsregion als rekombinante Proteine mit Hexahistidinresten in Insektenzellen mit dem Baculovirus-System exprimiert worden. Die SNAP-25 Proteine konnten bis zur offensichtlichen Homogenität in einem einzigen Reinigungsschritt über Nickelaffinitätschromatographie aufgereinigt werden. Es wurde mittels metabolischen Einbaus von 3H-Palmitinsäure dargestellt, dass SNAP-25 in Insektenzellen tatsächlich palmitoyliert wird und auch die Mutanten mit Doppelsubstitutionen der Cysteine noch 20-30% palmitoyliert vorliegen. Das beweist, dass beide Cysteinpaare direkt oder indirekt an der Palmitoylierung beteiligt und für eine vollständige Palmitoylierung notwendig sind. Durch Phasentrennung mit Triton X-114 konnte ein Anstieg des Hydrophobizitätsanteils von SNAP-25 durch Palmitoylierung auf 30% beobachtet werden. Im Gegensatz dazu befindet sich nicht acyliertes SNAP-25 ausschließlich in der wässrigen Phase. Dieser Hydrophobizitätsanstieg zeigt, dass ein signifikanter Anteil der SNAP-25 Moleküle palmitoyliert sein muss. Überraschenderweise zeigten sich große Oligomere von palmitoyliertem und nicht palmitoyliertem SNAP-25 im Elektronenmikroskop. Oligomere des palmitoyliertem sind wesentlich stabiler als die des nicht palmitoyliertem SNAP-25. Sie können außerdem unter nicht reduzierenden Bedingungen durch SDS-PAGE und unter reduzierenden, aber nicht-denaturierenden Bedingungen in Zweidimensionaler Gelelektrophorese detektiert werden. Die Oligomere konnten nach einem weiteren Reinigungsschritt mit Anionenaustauscher-chromatographie nicht mehr beobachtet werden. Es bleibt also unklar, ob die SNAP-25-Oligomere eine Eigenschaft von palmitoyliertem SNAP-25 sind oder durch eine im Coomassie-Gel nicht sichtbare Verunreinigung ausgelöst werden können. Aus Insektenzellen gereinigtes SNAP-25 bindet an die anderen neuronalen SNARE-Proteine Syntaxin1 und VAMP2. Der Palmitoylierungsgrad hat keinen bedeutenden Einfluss auf die SNARE-Komplex-Bildung. Der ternäre SNARE-Komplex mit palmitoyliertem SNAP-25 aus Insektenzellen besitzt die gleichen Eigenschaften wie der Komplex mit nicht palmitoyliertem SNAP-25. Er ist resistent gegen Behandlung mit SDS und lässt sich durch NSF und alpha-SNAP in Gegenwart von Adenosintriphosphat enzymatisch dissoziieren. Die Palmitoylierung von SNAP-25 hat eine Auswirkung auf die Bindung an künstliche Membranen. Während palmitoyliertes SNAP-25 zu 75% in Liposomen eingebaut werden kann, ist dies mit nicht palmitoyliertem nur zu einem geringen Prozentsatz (11%) möglich. Dieses Ergebnis unterstützt die postulierte Membranankerfunktion der Fettsäuren.