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In vitro und in vivo Effekte modifizierter Oligodesoxynukleotide im humanen Pankreaskazinommodell (2003)

Art

Hochschulschrift

Autor

March, Christina

Quelle

Berlin: Mensch und Buch Verl, 2003 — III, 163 Seiten

ISBN: 3-89820-657-2

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Institut für Tierpathologie

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Abstract / Zusammenfassung

This study deals with the effects of differently modified 15-mer oligodesoxynucleotides in a human pancreatic carcinoma model in vitro and in vivo concerning their cellular availabilities and their influences on the growing of tumor cells. For this purpose sequence specific effects of the MON and the influences of the 5}3}-terminal modifications of the phosphorothiotates were analysed. The superiority of terminal modified oligodesoxynucleotides over terminal unmodified oligodesoxynucleotides concerning their improved cellular uptake and subcellular distribution as well as the advantages in their inhibition of tumor growthwere evidenced by the results of numerous experiments. Normally the biterminal modification with Tocopherol was proved to be particularly favourable. Within the scope of a comparative in vitro analysis, carried out in this thesis,the MON Eviton® (rnd-mdr TT) - which was initially used as a control ON - showedthe strongest inhibition of tumor cell proliferation and induction of apoptosis of human pancreatic carcinoma cells. The cellular growth of several pancreatic carcinoma cell lines was decreased up to 96% by a treatment with Eviton® (3H-Thymidinincorporationsassay) and the viability of these cells was diminished up to 85% (EZ4U-Test). Furthermore an induction of apoptosis up to 80% was ascertained by DNA-fragmentation-assays and cell-cycle-analyses. A combined therapy of the tumor cells with Gemcitabine and Eviton® in vitro enhanced the growth inhibition significantly. Further investigations showed that the serum concentration of cell-culture medium had in vitro a very strong influence on the therapeutic effect and the cellular uptake of the MON. This was attributed to interactions between serum-proteins and MON. In vivo the successful cellular uptake of Cy3-labeled Eviton® could be shown in several tissues as well as an in solid tumor formations of the orthotopic tumor. Eviton® was also tested for the first time as therapeutic agent against pancreatic adenocarcinoma (PancTu-1) in a murine xenotransplant model and caused after atreatment with 3 mg-6 mg/kg KG daily a decrease up to 40% of the primary pancreatic tumor weight. At higher dosing (9 mg and 18 mg/kg KG daily) severe side effects appeared in vivo. These reactions could correspond with the effects of inhibition of proliferation founded in vitro after an Eviton® treatment of not-transformed cells. On the background that up to the present no adjuvant or palliative therapy of the pancreatic adenocarcinoma exists which contributes to an increased long-term-survival, Eviton® could come up clinical relevance in anticancer treatment. Next steps for this aim are studies which should explain the mechanisms of action of the therapeutic effects and the toxicology of Eviton®. Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurden verschieden modifizierte 15-mer Oligodesoxynukleotide im humanen Pankreaskarzinommodell in vitro und in vivo hinsichtlich ihrer zellulären Verfügbarkeit und ihres Einflusses auf das Tumorzellwachstum untersucht. Hierbei wurden die sequenzspezifischen Effekte der MON und die Einflüsse 5}3}-terminaler Modifikationen der Phosphorothioat-ON analysiert. Die Überlegenheit terminal modifizierter Oligodesoxynukleotide gegenüber terminal unmodifizierten Oligodesoxynukleotiden sowohl hinsichtlich der verbesserten zellulären Aufnahme und subzellulären Verteilung als auch die Vorteile bezüglich ihrer antitumoralen Wirkung zeigten die Ergebnisse zahlreicher Versuche. Hierbei erwies sich wiederholt die biterminale Modifikation mit Tocopherol als besondersgünstig. Im Rahmen einer in dieser Arbeit durchgeführten vergleichenden in vitro-Analyse wurde das ursprünglich als Kontrolle eingesetzte MON Eviton® (rnd-mdr TT) aufgrund seiner stärksten antiproliferativen und apoptoseinduzierenden Wirkung auf Pankreaskarzinomzellen für weitere Untersuchungen ausgewählt. Das Zellwachstum diverser Pankreaskarzinomzelllinien wurde durch eine Eviton®-Behandlung um bis zu 96% (3H-Thymidininkorporationsassay) und die Zellvitalität um bis zu 85% (EZ4U-Test) reduziert. Des Weiteren wurde eine Apoptoseinduktion von bis zu 80% in DNA-Fragmentierungsassays sowie in Zellzyklusanalysen festgestellt. Eine Kombinationsbehandlung der Tumorzellen mit Gemcitabine und Eviton® in vitro steigerte signifikant die Wachstumshemmung. Weitere Untersuchungen zeigten, dass in vitro der Serumgehalt im Zellkulturmedium einen starken Einfluss auf die Wirksamkeit und die zelluläre Aufnahme der MON hatte, welcher auf Protein-MON Wechselwirkungen zurückzuführen ist. In vivo wurde in einer Aufnahmestudie die erfolgreiche zelluläre Aufnahme von Cy3-markiertemEviton® in diverse Gewebe inklusive solider Tumorformationen des orthotopen Tumors ersichtlich. Eviton® wurde ebenfalls erstmalig zur Therapie etablierter Pankreasadenokarzinome (PancTu?1) im murinen orthotopen Xenotransplantationsmodell eingesetzt und bewirkte in einer Dosierung von 3 mg -6 mg/kg KG täglich eine bis zu 40%-ige Reduktion des Primärtumorgewichtes. In höherer Dosierung (9 mg und 18 mg/kg KG täglich) traten in vivo toxische Nebenwirkungen auf. Diese könnten mit den in vitro beobachteten antiproliferativen Effekten von Eviton® auf nicht-transformierte Zellen korrespondieren. Vor dem Hintergrund, dass es bis heute keine etablierte adjuvante oder palliative Therapie des Pankreasadenokarzinoms mit lebensverlängernder Wirkung gibt, könnte Eviton® klinische Relevanz in der Krebstherapie zukommen. Nächste Schritte hierzu sind Studien zur Klärung der Wirkmechanismen und der Toxikologie von Eviton®.