Fachbereich Veterinärmedizin


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    Entwicklung eines indirekten ELISA zum Nachweis von Infektionen mit potenziell onkogenen Gammaherpesviren beim Schwein als Beitrag zur Virussicherheit in der Xenotransplantation (2004)

    Art
    Hochschulschrift
    Autor
    Brema, Susanne
    Quelle
    Berlin: Mensch und Buch Verl, 2004 — X, 150 Seiten
    ISBN: 3-89820-737-4
    Verweise
    URL (Volltext): http://www.diss.fu-berlin.de/diss/receive/FUDISS_thesis_000000001332
    Kontakt
    Institut für Tierpathologie

    Robert-von-Ostertag-Str. 15
    Gebäude 12
    14163 Berlin
    +49 30 838 62450

    Abstract / Zusammenfassung

    Ergänzend zum direkten Nachweis von Infektionen mit den erst kürzlich entdeckten "Porzinen lymphotropen Herpesviren Typ 1-3" (PLHV-1, -2 und -3) beim Schwein mittels PCR sollte erstmalig eine indirekte Methode entwickelt werden, mit der PLHVInfektionen durch Nachweis von Antikörpern im Serum diagnostiziert werden können. Der Vorteil des indirekten Nachweises gegenüber dem direkten ist, dass mit diesem Verfahren auch nicht-virämische und latent-infizierte Tiere erkannt werden, was mit der PCR-Untersuchung von Blutleukozyten nicht möglich ist. Ziel dieser Arbeit war daher die Entwicklung eines Antikörpertestes (ELISA). Der Entwicklung eines ELISA zum serologischen Nachweis von PLHV-Infektionen bei Schweinen kam insofern eine besondere Bedeutung zu, da durch PCR-Untersuchungen festgestellt worden war, dass sich PLHV vermehrt in den Organen aufhält, die am lebenden Tier nur schwer zugänglich sind. Zum Aufbau des ELISA und für Untersuchungen mittels Western Blot wurden rekombinante Proteine von PLHV erzeugt. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand das Glykoprotein B, das für die Gewinnung von Referenzseren in Mäusen sowie zur Beschichtung von Mikrotiterplatten verwendet wurde. Mit dem ELISA wurden Seren von Schweinen unterschiedlicher geographischer Herkunft und verschiedenen Alters untersucht, die sowohl unter konventionellen als auch unter SPF-Bedingungen aufgezogen worden waren. Die beobachtete Seroprävalenz von PLHV bei vier bis sechs Monate alten Schweinen betrug 90-100%. Im Vergleich dazu betrug die Seroprävalenz von drei Wochen alten Ferkeln nur 38%. Auch bei PCR-negativen Schweinen, deren Blutleukozyten durch konventionelle oder quantitative PCR untersucht worden waren, wurden anti-PLHV-gB-Antikörper detektiert. Diese Beobachtung unterstützte das Ergebnis bereits erfolgter PCR-Untersuchungen, wonach sich PLHV mittels PCR vermehrt in den Organen und weniger häufig in den Blutleukozyten nachweisen lässt. Die regelmäßige serologische Untersuchung von zwölf Schweinen vom Tag der Geburt bis zu einem Alter von fünf Monaten zeigte, dass alle Tiere maternale anti-PLHV-Antikörper über das Kolostrum aufgenommen haben, die innerhalb der ersten vier Lebenswochen kontinuierlich abgebaut wurden. Nach diesem Zeitraum nahm der Gehalt an anti-PLHV-Antikörpern wieder zu. Dieser Anstieg kann durch eine Erstinfektion der Ferkel erklärt werden, die darauf mit der Eigensynthese von Antikörpern reagierten. Die Ergebnisse von PCR-Untersuchungen unterstützten diese Beobachtung. In den ersten zwei Lebenswochen konnte bei keinem Tier Virus-DNA mittels PCR in den Blutleukozyten detektiert werden. In der dritten Lebenswoche waren 17% der untersuchten Tiere PCR-positiv für PLHV, im Folgezeitraum stieg der Anteil auf 42-50%. Diese Beobachtungen sprechen für eine postnatale Infektion mit PLHV. Dadurch ist die Möglichkeit gegeben, PLHV-freie Schweine für die Xenotransplantation zu züchten. Die ELISA-Ergebnisse konnten exemplarisch im Western Blot reproduziert werden. Bei diesen Untersuchungen wurde ein im ORF52 kodiertes Kapsidprotein als weiteres immunogenes PLHV-Protein identifiziert, das für weiterführende serologische Untersuchungen herangezogen werden kann. Um einen ersten Eindruck über mögliche Infektionen in der Xenotransplantation zu bekommen, wurden Humanseren im ELISA und im Western Blot untersucht. Neben Seren gesunder Blutspender wurden Seren von Schlachtern untersucht, die über einen längeren Zeitraum Blut-zu-Blut-Kontakt zu Schweinen hatten und Seren von Xenotransplantierten, denen porzine Inselzellen des Pankreas implantiert worden waren oder deren Blut für mehrere Stunden über einen mit porzinen Leberzellen ausgekleideten Bioreaktor geführt worden war. Weder bei den Schlachtern noch bei den Xenotransplantierten wurden Hinweise für eine PLHV-Infektion gefunden. Allerdings kann eine Empfänglichkeit des Menschen für PLHV nicht mit 100%iger Sicherheit ausgeschlossen werden, weil bei den untersuchten Personengruppen die Kontaktzeiten zu porzinen Blut und Gewebe in allen Fällen nur kurz und die Anzahl implantierter Zellen gering war. Außerdem standen die Xenotransplantierten nicht oder nur unter schwacher Immunsuppression. Diese Bedingungen spiegeln die wirklichen Umstände, wie sie bei der Xenotransplantation ganzer Organe vorliegen, keinesfalls wider, da eine viel größere Zellzahl transplantiert wird und die Patienten viel stärker immunsupprimiert werden. Durch Verwendung transgener Spendertiere besteht zusätzlich die Gefahr, dass die Komplement-vermittelte Virolyse eingeschränkt ist. Der mögliche Übertritt von PLHV aus porzinen Organen auf den Menschen kann deshalb gegenwärtig nicht ausgeschlossen werden. Allerdings besteht die Möglichkeit, dieses Risiko auf ein Minimum zu reduzieren, indem zukünftige Spendertiere mit den in dieser Arbeit entwickelten Methoden überwacht werden. Damit steht erstmals eine indirekte Methode zum Nachweis von PLHV-Infektionen bei Schweinen zur Verfügung, die ergänzend zur PCR-Untersuchung von Blutlymphozyten und der Milz für diagnostische Zwecke eingesetzt werden kann.