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Assessment of the effects of the probiotic Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415) on the immune defense of piglets in vivo and in vitro in the context of microbial infections (2009)

Art

Hochschulschrift

Autor

Gebreselassie, Eden Ephraim

Quelle

Berlin, 2009 — VIII, 129 Seiten

Sprache

Englisch

Verweise

URL (Volltext): http://www.diss.fu-berlin.de/diss/receive/FUDISS_thesis_000000014081

Kontakt

Institut für Immunologie

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immunologie@vetmed.fu-berlin.de

Abstract / Zusammenfassung

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, durch zwei verschiedene Vorgehensweisen die
immunologischen Effekte des probiotischen Stammes Enterococcus faecium SF68 (NCIMB
10415) auf Ferkel einzuschätzen.

Zunächst wurde ein in vivo Modell genutzt, bei dem die Ferkel in zwei Gruppen – eine
probiotische (43 Ferkel, die als Präparat den Stamm E. faecium SF68 verabreicht bekamen)
und eine Kontrollgruppe (46 Ferkel ohne probiotisches Präparat) – eingeteilt wurden.
Beide Gruppen wurden mit dem Stamm Salmonella typhimurium DT104 infiziert.
Zufällig ausgewählte Ferkel jeden Wurfs wurden 3, 24 und 72 Stunden sowie 28 Tage post
infectionem (p. i.) getötet. PBMC, CD4+-Lymphocyten aus der Milz und einzelnen
Peyer’sche Plaques (PP), Lymphocyten aus dem distalen PP und CD8+-Lymphocyten aus den
intraepithelialen Lymphocyten (IEL) des Jejunums wurden durch Einsatz verschiedener
Protokolle und des Magnetic Cell Sorting Prinzips (MACS) isoliert.

Durchflußzytometrische Bestimmung der CD8+-Lymphocyten im IEL aus Ferkeln beider
Versuchsgruppen ergab im Einklang mit früheren Untersuchungen eine signifikante
Reduktion in der probiotischen Gruppe 24 Stunden nach Infektion mit Salmonellen.
Die relative Anzahl von CD4+-Zellen in den einzelnen PP und der Milz war tendetiell höher in Ferkeln der probiotischen Gruppe. Aus allen isolierten Zellen wurde RNA gewonnen und
komplementäre DNA (cDNA) hergestellt. Mit der cDNA aus den Proben der PBMC und aus
dem distalen PP wurde eine real-time PCR durchgeführt, um die Genexpression
verschiedener Cytokine/Chemokine und Rezeptoren zu überprüfen. Unsere Ergebnisse
zeigten eine signifikante Hochregulation der Gene für TLR2, IL-1a, IL-1ß und IL-8 in den
PBMC und IL-1a in den distalen PP der Ferkel aus der probiotischen Gruppe 71 Stunden
nach Infektion mit Salmonellen. Obwohl die Entzündungsreaktion nicht vermindert werden
konnte, wird hier erstmals die Hochregulation der antientzündlichen Gene TLR-9, CD9 und
TGF-ß durch den probiotischen Stamms E. faecium SF68 gezeigt.

Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde ein in-vitro Modell genutzt, um die
immunologischen Auswirkungen des Stammes E. faecium SF68 auf die vermerung des
Transmissiblen Gastroenteritis-Virus (TGEV) in Epithelzellen zu untersuchen. Diese Arbeit
ist die erste, die den Effekt eines Probiotikums gegen TGEV erforscht. Da Probiotika
hauptsächlich im Darm wirken, also dort, wo sich TGEV-Infektionen etablieren, ist der
Einsatz einer adäquaten intestinalen Zelllinie porcinen Ursprungs entscheidend.
Daher wurden zwei früher isolierte Zelllinien (Typ I- und Typ II-Zellen) aus dem Epithel von Ferkeln durch Einsatz morphologischer (Licht- und Transmissionselektronenmikroskop,
FACS), histochemischer (FACS und Fluoreszenzmikroskopie) und molekularer (RT-PCR)
Methoden sowie hinsichtlich ihrer Sensitivität gegenüber TGEV charakterisiert.
Die erzielten Ergebnisse lassen vermuten, dass beide Zelllinien epithelialer Natur sind und nur die Typ IIZellen mit TGEVinfiziert werden können. Typ II-Zellen produzierten höhere Virustiter als ST-Zellen, die das für Untersuchungen zu TGEV etablierte Zelllinien-Modell darstellen, aber ursprünglich nicht aus dem Darm stammen. Folglich können Typ II-Zellen künftig als adäquate porcine Epithelzelllinie für in-vitro Untersuchungen von TGEV genutzt werden.

Um den antiviralen Effekt des Probiotikums auf TGEV zu untersuchen, wurden Monolayer
der Typ II-Zellen vor der Infektion mit dem Virus mit dem Stamm E. faecium SF68
vorbehandelt. Anschließend wurde der Anstieg überlebender Zellen mittels MTT-Test
ermittelt und mit den Ergebnissen der nicht vorbehandelten Kontroll-Monolayern verglichen.
Zusätzlich wurden die Virustiter der probiotisch vorbehandelten und nicht vorbehandelten
infizierten Monolayer der Typ II-Zellen durch Einsatz der TCID50 Titrationsmethode von
ST-Zellen bestimmt. Die Ergebnisse zeigen einen Abfall der viralen Aktivität und der
Virustiter als Resultat der Vorbehandlung mit dem Stamm E. faecium SF68. Um die
molekularen Ergebnisse der Schutzeffekt vom Probiotika gegenüber TGEV infektion zu
bestätigen, wurde eine real-time PCR-Analyse durchgeführt, um den Grad der Genexpression
von IL-6, IL-8 und IFN-g zwischen den Typ II-Kontrollzellen, probiotisch vorbehandelten
Zellen, mit TGEV infizierten Zellen und Zellen, die sowohl probiotisch vorbehandelt als auch mit TGEV infiziert wurden, zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigen, dass durch die virale Infektion die Expression der oben erwähnten Gene verglichen mit der Expression in der probiotisch vorbehandelten Gruppe stark signifikant hochreguliert werde.
Die virusinduzierte Hochregulation der oben erwähnten Gene für Entzündungfaktoren ließ sich durch Vorbehandlung mit dem Stamm E. faecium SF68 reduzieren. Die Ergebnisse deuten draufhin, dass die nützlichen Effekts des Probiotikums in einer Reduktion der
Entzündungszytokinen liegt, die durch infektiöse Agentien hervorgerufen werden.