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Effizienter Gentransfer in murine embryonale Stammzellen mittels Nukleofektion:
Vergleich mit lentiviraler Transfektion (2005)

Art

Hochschulschrift

Autor

Lorenz, Peer (WE 5)

Quelle

— 95 Seiten

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Institut für Virologie

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Abstract / Zusammenfassung

Die Fähigkeit von embryonalen Stammzellen (ES), sich in eine Vielzahl verschiedener Zelltypen zu differenzieren, beinhaltet vielversprechende Möglichkeiten, um zum einen entwicklungsbiologische Abläufe zu studieren zum anderen aber auch für die therapeutische Anwendung in der Zell- und Gentherapie. Für die genetische Manipulation von ES existiert eine Vielzahl von viralen und nicht-viralen Techniken. In der vorliegenden Arbeit wurde die seit kurzem entwickelte Methode der Nukleofektion (2003), mit der z.B. Plasmid-DNA direkt in den Kern eukaryotischer Zellen transferiert wird, für den Einsatz an embryonalen Stammzellen untersucht. Für die Versuche wurde ein Plasmid verwendet, das die kodierende Information für das grün-fluoreszierende Protein (GFP) und eine Geneticin-resistenz aufwies. Um diese neue Technologie mit einer etablierten Methode zu vergleichen, wurden lentivirale Transfektionen mit einem NL-CEF-EGFP Vektor an den ES durchgeführt. 24 Stunden nach der Nukleofektion verringerte sich die ES-Vitalität von 77 % auf 40 %. Die Transfektionseffizienz betrug bei den überlebenden Zellen 85-96 %. Anschließend wurde mit Hilfe der Geneticinresistenz eine stabil transfizierte ES-Population selektiert. Während der ersten Woche sank die GFP-Expression unter Selektionsdruck des Geneticin auf 50 %, stieg aber im weiteren Verlauf wieder an und erreichte nach vier Wochen wieder 70 % mit steigender Tendenz. Die lentivirale Transfektion wurde mit Variationen während der Inkubationszeit (5 und 24 Stunden) und steigender Viruskonzentrationen (MOI 25, 50, 75 und 100) durchgeführt. Um die Transfektionseffizienz weiter zu steigern wurden zusätzlich Ansätze mit zwei Polykationen (DEAE und Polybrene?) getestet. Die maximale Transfektionseffizienz lag bei 1,6 % GFP-positiver Zellen. Diese stabil GFP-transfizierten ES wurden anschließend durch-flußzytometrisch (FACS-sort) angereichert. Ob die ES auch nach einer genetischen Manipulation ihre stammzellspezifischen Eigen-schaften behalten, wurde anhand der Expression des Stammzellmarkers SSEA-1, sowie der Befähigung zur Bildung von ?embryoid bodies? untersucht. Zusätzlich erfolgte die Differ-enzierung zu einem neuroepithelialen Gewebe als Nachweis der erhaltenen Pluripotenz. Zusammenfassend ergibt sich für die Nukleofektion, daß sie eine hocheffiziente Methode für die genetische Manipulation von embryonalen Stammzellen darstellt und alternativ zu den viralen Systemen eingesetzt werden kann.