Fachbereich Veterinärmedizin


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    Receptor interacting proteins : die Rolle der NF-Kappa-B-Aktivatoren bei der Wundheilung der Haut und der epidermalen Differenzierung (2008)

    Art
    Hochschulschrift
    Autor
    Adams, S. C. J.
    Quelle
    Berlin: Mensch und Buch Verl, 2008 — [4], 137 Seiten
    ISBN: 978-3-86664-513-4
    Verweise
    URL (Volltext): http://www.diss.fu-berlin.de/diss/receive/FUDISS_thesis_000000007346
    Kontakt
    Institut für Veterinär-Biochemie

    Oertzenweg 19 b
    14163 Berlin
    Tel.+49 30 838 62225 Fax.+49 30 838-62584
    email:biochemie@vetmed.fu-berlin.de

    Abstract / Zusammenfassung

    Die Receptor Interacting Proteins (RIPs) übernehmen als zytoplasmatische Adaptorproteine insbesondere des TNF-Rezeptors Typ I fundamentale Funktionen bei der intrazellulären Feinabstimmung lebenswichtiger Prozesse. Während für RIP4 bereits eine essentielle Rolle bei der embryonalen Entwicklung ektodermaler Gewebe nachgewiesen wurde, war ansonsten über die Bedeutung dieser Proteinfamilie für die Haut sowie deren Wundheilung vor Beginn dieser Arbeit nichts bekannt. Dabei erfordert insbesondere die Verletzung des feinstrukturierten Gewebes der Haut eine komplexe Reorganisation, welche über exakt abgestimmte Mechanismen durch eine Vielzahl beteiligter Zelltypen gesteuert wird. Dies erfolgt in einem hohen Maße über die Freisetzung von Wachstumsfaktoren und Zytokinen, deren Signale über unterschiedliche Rezeptoren in das Zellinnere weitergeleitet werden. Aufgrund der besonderen Bedeutung der Rezeptoren vom TNFR-Typ für den Wundheilungsprozess war es das Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit, die keratinozytenspezifische Bedeutung der RIPs in der Haut sowie bei der Wundheilung zu analysieren.

    Hierfür wurde zunächst die basale Expression der einzelnen rip-Gene im intakten Hautgewebe sowie deren Regulation im Heilungsverlauf muriner Exzisionswunden untersucht. Bei diesen in vivo-Expressionsanalysen wurde keine Regulation der moderat exprimierten rip-Gene 1, 2 und 5 beobachtet. Demgegenüber ließ sich für das rip3-Gen eine massive Induktion während der inflammatorischen Phase der Wundheilung nachweisen, welche sich in den Zellen des Granulationsgewebes lokalisieren ließ. Hingegen wurde für das in den Keratinozyten der Basalschicht stark exprimierte rip4-Gen eine massive Repression während der frühen Wundheilung beobachtet, die sich in den Keratinozyten des hyperproliferativen Epithels lokalisieren ließ.

    Darauf aufbauend wurden zudem die Expressionsmuster der rip-Gene unter proliferations- sowie differenzierungsförderlichen Kultivierungsbedingungen von Keratinozyten in vitro untersucht. Auch hierbei ließ sich keine Regulation der Expression der rip Gene 1, 3 und 5 nachweisen, während das Expressionsniveau des rip2-Gens bei HaCaT-Zellen mit deren Proliferationsrate korrelierte, was sich jedoch in primären Keratinozyten nicht bestätigen ließ. Die Expression des rip4-Gens wies hingegen sowohl in HaCaT-Zellen als auch in primären Keratinozyten eine enge Assoziation mit der frühen Differenzierung auf, womit sich bereits andeutete, dass RIP4 an der Regulation der Keratinozytendifferenzierung beteiligt sein könnte.

    Vor diesem Hintergrund wurde in vitro untersucht, welche Faktoren an der Repression des rip4-Gens in Keratinozyten nach Verwundung beteiligt sein könnten. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass sehr unterschiedliche Faktoren, welche größtenteils auch wichtige Regulatoren der Wundheilung in vivo sind, eine Repression der rip4-Genexpression bewirken können: sowohl Serum als auch EGF, TGF-β1, Activin A, proinflammatorische Zytokine und Wasserstoffperoxid führten zu einer Hemmung der rip4-Expression. Diese Hemmung ließ sich jedoch teilweise durch Inhibitoren des Transkriptionsfaktors NF-κB blockieren, wobei sich insbesondere nach Applikation von Dexamethason eine komplette Aufhebung der rip4-Genrepression nach Verwundung in vitro nachweisen ließ. Begleitet wurde diese Dysregulation von einem vollständig unterbleibenden Wundverschluss der Keratinozyten-Monokultur, was auf eine besondere Bedeutung der Regulation der
    rip4-Expression für die Reepithelisierung nach Verwundung hinweist.

    Zur näheren Charakterisierung der funktionellen Bedeutung von RIP4 in Keratinozyten wurde schließlich die Expression des rip4-Gens in kultivierten HaCaTZellen mittels siRNA gehemmt. Anschließende Untersuchungen der Keratinozyten zeigten, dass die Hemmung der rip4-Genexpression weder eine veränderte Proliferationsrate noch eine Regulation von proliferationsassoziierten Genen nach sich zog. Demgegenüber ließ sich insbesondere für Gene, welche mit der frühen und mittleren Differenzierungsphase von Keratinozyten assoziiert sind, eine temporär induzierte Expression nachweisen. Zusammen mit den Ergebnissen der in vivo-Analysen zur Lokalisation der rip4-Genexpression im Hautgewebe konnte somit gezeigt werden, dass das RIP4-Protein an der Regulation der frühen Differenzierung von Keratinozyten beteiligt ist.

    Zudem konnte nachgewiesen werden, dass RIP4 die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB in Keratinozyten bewirkt. Da auch über die Bedeutung von NF-κB für die Wundheilung der Haut vor Beginn dieser Arbeit wenig bekannt war, wurde auch dessen Aktivierung im Verlauf der Wundheilung untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Aktivität von NF-κB bei der Wundheilung der Haut einer differentiellen Regulation unterliegt. Insbesondere in Zellen des Granulationsgewebes sowie des hyperproliferativen Epithels ließ sich eine massive Aktivierung nachweisen. Wundheilungsstudien an IκBαDN-Mäusen, in denen die Aktivität des NF-κB auf ein Minimum reduziert ist, zeigten zudem, dass die mangelnde NF-κBAktivierung zu einem ausgeprägten inflammatorischen Wundheilungs-Phänotyp führt, der mit einer verminderten Ausbildung des hyperproliferativen Epithels einhergeht. Ähnlich wie nach Dexamethason-Applikation in vitro führte die eingeschränkte NF-κB-Aktivität zudem auch in vivo zu einer stagnierenden, hohen Expression des rip4-Gens nach Verwundung.

    Insgesamt konnte somit nachgewiesen werden, dass die Gene, die für die verschiedenen Receptor Interacting Proteins kodieren, in Keratinozyten charakteristische Expressionsmuster aufweisen. Während rip1-3 sowie rip5 größtenteils lediglich moderat exprimiert und nicht reguliert werden, unterliegt das rip4-Gen einer komplexen Regulation und übernimmt in Keratinozyten eine bedeutende Funktion sowohl bei der Reepithelisierung nach Verwundung als auch bei der epidermalen Differenzierung.