Fachbereich Veterinärmedizin


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    Wirkung von rekombinantem humanem aktiviertem Protein C auf humane Endothelzellen und endotheliale Progenitorzellen (2009)

    Art
    Hochschulschrift
    Autor
    Glasl, C
    Quelle
    Berlin: Mensch und Buch Verl., 2009 — VIII, 140 Seiten
    ISBN: 978-3-86664-692-6
    Verweise
    URL (Volltext): http://www.diss.fu-berlin.de/diss/receive/FUDISS_thesis_000000015452
    Kontakt
    Institut für Veterinär-Anatomie

    Koserstr. 20
    14195 Berlin
    Tel.+49 30 838 53555 Fax.+49 30 838-53480
    email:anatomie@vetmed.fu-berlin.de

    Abstract / Zusammenfassung

    Das körpereigene „Aktivierte Protein C“ (APC) nimmt aufgrund seiner antikoagulativen und profibrinolytischen Wirkung eine Schlüsselfunktion in der Regulation der Blutgerinnung und der Aufrechterhaltung des hämostatischen Gleichgewichts ein. Darüber hinaus vermittelt APC antiinflammatorische und zytoprotektive Effekte, wodurch es auch als Entzündungs-modulator fungieren kann. Da das Krankheitsbild der Sepsis mit einer überschießenden Gerinnungsaktivierung sowie einer systemischen Entzündungsreaktion verbunden ist, gewann rekombinantes humanes APC (rhAPC) im Rahmen der Sepsistherapie an Bedeu-tung. Zahlreiche Studien an Patienten mit schwerer Sepsis belegen, dass eine Behandlung mit rhAPC die Mortalitätsrate senkt und den weiteren Verlauf der Erkrankung positiv beein-flusst. Bis heute stellt die Sepsis das einzige Indikationsgebiet für rhAPC dar, jedoch scheint dieses multifunktionale Antikoagulanz ein weitaus größeres Einsatzspektrum zu besitzen.
    In diversen Tier-Modellen konnten in vivo angiogene Effekte von rhAPC nachgewiesen werden; die molekularen Grundlagen dieser Effekte sind jedoch weitgehend unbekannt. Aufgabe der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss von rhAPC auf die Vaskulogenese
    (de novo-Bildung von Gefäßen) und die Angiogenese (Aussprossung von Kapillaren aus bestehenden Gefäßen) in vitro zu untersuchen sowie die molekularen und zellulären Wirkmechanismen gefäßbildender Effekte zu erforschen. Hierzu wurden im Zellkultur-experiment Stimulationsversuche mit rhAPC an endothelialen Progenitorzellen (EPCs) und humanen Endothelzellen (HUVECs) durchgeführt.
    Die Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung der EPCs erfolgte gemäß persönlicher Mitteilung der Gruppe Urbich/Dimmeler und in Anlehnung an ihre Veröffentlichungen (Dimmeler et al., 2001; Urbich und Dimmeler, 2004). Über Ficoll-Isolierung wurden mono-nukleäre Zellen aus „buffy coats“ isoliert und unter speziellen Bedingungen angezüchtet, die eine Ausdifferenzierung von EPCs begünstigen. Die Detektion der EPCs erfolgte durch Prüfung morphologischer und funktioneller Zelleigenschaften (LDL-Aufnahme, Lektin-Bindung) und durch den Nachweis spezifischer Oberflächenmoleküle in der FACS-Analyse. Die Zellen exprimierten die charakteristischen Marker VEGFR-2, CD34 (schwach), CD133 (schwach), CD31, vWF und CD105. Abweichend von Literaturvorgaben (Bompais et al., 2004; Smadja et al., 2006b) wurde das Adhäsionsmolekül CD146 nicht exprimiert. Da die FACS-Analyse im Vergleich zu anderen Gruppen zu einem früheren Zeitpunkt durchgeführt wurde, ist anzunehmen, dass die hier isolierten EPCs eine unreifere EPC-Population dar-stellen, die diesen Endothelzellmarker noch nicht exprimiert. Anhand von CD146 konnte hier erstmals eine Unterscheidung zwischen „frühen“ EPCs und HUVECs vorgenommen werden.
    Da die Wirkung von rhAPC bisher noch nicht an EPCs getestet wurde, sollte zunächst ermittelt werden, ob EPCs Effektorzellen von APC sind. Hierzu wurde untersucht, ob EPCs die für die APC-Wirkung verantwortlichen Rezeptoren (PAR-1, PAR-2, EPCR und S1P1) exprimieren. Mittels RT-PCR konnten alle genannten APC-Rezeptoren in den EPCs auf Genebene detektiert werden. Der Nachweis auf der Zelloberfläche erfolgte in der FACS-Analyse, wobei die APC-relevanten Rezeptoren, mit Ausnahme von PAR-2, darstellbar waren. In darauf folgenden Stimulationsversuchen (RT-PCR) steigerte rhAPC die Gen-expression des Rezeptors PAR-1 in EPCs. Die Expression der Rezeptoren PAR-2, EPCR und S1P1 wurde durch rhAPC nicht verändert.
    In weiteren Experimenten (RT-PCR, ELISA) wurde untersucht, ob rhAPC die Gen-expression bzw. die Synthese wichtiger Mediatoren der Vaskularisation beeinflusst. Hierbei bewirkte rhAPC eine Expressionssteigerung des Wachstumsfaktors „vascular endothelial growth factor-C“ (VEGF-C) in HUVECs sowie eine zeit- und dosisabhängige Erhöhung der endothelialen VEGF-C-Freisetzung. In EPCs wurde der angiogen und vaskulogen wirkende Mediator Angiopoietin-2 (Ang-2) vermehrt nach Stimulation mit rhAPC exprimiert.
    In einem Screening-Verfahren (Real-Time RT-PCR) wurde ein Genexpressionsprofil von EPCs nach Stimulation mit rhAPC erstellt. RhAPC zeigte hier ein indirekt proangiogenes Potential, indem es die Expression angiostatischer Gene (Interferon-γ, CXCL-Chemokin-4;
    -9; -10; Angiopoietin-like-4; Thrombospondin-2) verminderte und das stark angiogene Leptin hochregulierte. Daneben könnte rhAPC auch indirekt entzündungshemmend durch Herab-setzung der Expression proinflammatorischer Gene (Interferon-y; TNF; PDGF-A, CXCL-Chemokin-1; -3; -4; -5; -9 und -10, Ephrin A1- und B2) wirken.
    Weiterhin wurde untersucht, ob rhAPC einen Einfluss auf die Proliferation von EPCs ausübt. In Stimulationsversuchen konnte gezeigt werden, dass rhAPC die Zellzahlen von EPCs signifikant in vitro steigert. Dieser proliferative Effekt fördert die de novo-Bildung von Gefäßen, da die vaskulogene Aktivität mit der Zahl zirkulierender EPCs korreliert.
    Die Ergebnisse dieser Studie belegen, dass rhAPC potentiell die Entstehung neuer Gefäße vermitteln kann. Der Mechanismus der Angiogenese könnte von rhAPC indirekt aktiviert werden, indem es die Expression und Freisetzung proangiogener Wachstums-faktoren in HUVECs und EPCs steigert, während es angiostatisch wirkende Gene herab-reguliert. Erstmalig konnte hier auch eine indirekt vaskulogene Wirkung von rhAPC konsta-tiert werden, die auf einer Erhöhung der Anzahl von EPCs (Proliferationssteigerung und Mobilisierung aus dem Knochenmark durch VEGF-C und Ang-2) beruht. Zudem wurde eine indirekt antiinflammatorische Beeinflussung der Genexpression durch rhAPC festgestellt.
    Die vorliegende Doktorarbeit kann dazu beitragen, neue therapeutische Indikationen von rhAPC im Rahmen der Revaskularisierung ischämischer Gewebe zu erschließen (z.B. bei Traumata, kardiovaskulären Verschlusserkrankungen oder Diabetes).