Fachbereich Veterinärmedizin


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    Die Rolle Pertussistoxin-sensitiver G-Proteine bei der Auslösung der Akrosomreaktion in Säugetierspermien (2002)

    Art
    Hochschulschrift
    Autor
    Severin, Ulrich
    Quelle
    Berlin, 2002 — 91 Seiten
    Verweise
    URL (Volltext): http://www.diss.fu-berlin.de/diss/receive/FUDISS_thesis_000000000692
    Kontakt
    Tierklinik für Fortpflanzung

    Königsweg 65
    Haus 27
    14163 Berlin
    +49 30 838 62618
    fortpflanzungsklinik@vetmed.fu-berlin.de

    Abstract / Zusammenfassung

    Seit langem wird die Beteiligung von G-Proteinen der Gi-Familie an der Signaltransduktion der AR diskutiert, wobei die dazu durchgeführten Untersuchungen mit Pertussistoxin (PTX) als zellbiologischem Werkzeug durchgeführt wurden. Die Effizienz der PTX-Behandlung von Spermatozoen verschiedener Spezies wurde allerdings nie systematisch überprüft. Die vorliegende Arbeit hatte deshalb das Ziel, anhand funktioneller und biochemischer Testverfahren systematisch den Einfluss von PTX auf die an der AR beteiligten G-Proteine zu untersuchen, um die katalytische Wirkung des Toxins von einem unspezifischen Effekt auf Säugetierspermatozoen abzugrenzen. Als zentrales, die AR auslösendes Ereignis, wird der Ca2+-Einstrom nach Bindung an die ZP angenommen. Mit Hilfe der fluorimetrischen [Ca2+]i-Bestimmungen konnte in Eberspermien gezeigt werden, dass der durch den Gi-Protein-Aktivator Mastoparan-induzierte Ca2+-Influx PTX-insensitiv ist. PTX-vorbehandelte Eberspermien reagierten ebenso wie die Spermien aus der Solvenskontrolle mit einem schnellen, langanhaltenden Einstrom von Ca2+-Ionen auf nahezu identische Plateaus. Während der sechsstündigen Kapazitation kommt es nicht zur Inaktivierung des Toxins, wie die fluoreszenzmikroskopische Bestimmung von Chemokin-stimulierten Ca2+-Transienten in Co-inkubierten HL-60-Zellen zeigen konnte. Ein unspezifischer Effekt von PTX auf Spermatozoen, der die funktionelle Integrität der Zellen beeinträchtigt, konnte anhand des Zona pellucida-Bindungs-Assays ausgeschlossen werden. In Gegenwart von PTX kapazitierte Eber-und Bullenspermien banden mit vergleichbarer Effizienz an homologe Zonae wie die Solvens-behandelten Kontrollen. Da nur kapazitierte Spermien an die Zona pellucida binden können, lässt sich mit diesem Testverfahren die Kapazitation als funktioneller Parameter erfassen. Im Zusammenhang mit der PTX-Insensitivität des Mastoparan-vermittelten Ca2+-Einstroms wurden die Auswirkungen der PTX-Vorbehandlung auf die Mastoparan-induzierte Akrosomreaktion an Eberspermien untersucht. Mastoparan löst in PTX ?behandelten kapazitierten Eberspermien eine AR mit nahezu identischer Effizienz aus wie in Kontrollspermien. Um festzustellen, welche Auswirkung PTX auf die Zona pellucida-induzierte AR kapazitierter Spermatozoen hat, wurde durch Doppelfärbung mit PNA-gekoppeltem FITC und Ethidium-Homodimer1 der akrosomale Status Zona-gebundener Eberspermien bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass die Zona pellucida-induzierte AR nicht durch PTX-Vorbehandlung hemmbar ist. Aus diesen Befunden ergab sich der Verdacht, dass PTX nicht in der Lage ist, während der Kapazitation in intakte Säugetierspermatozoen zu gelangen und dort Gi-Proteine zu ADP-ribosylieren. Daher wurden zunächst die Expressionsniveaus von Gi-Proteinen in Membranen von humanen, porcinen, murinen, und bovinen Spermien durch metabolische Markierung mit 32P-NAD+ als Substrat für PTX erfasst. Es konnte mit Ausnahme des Rindes in den Membranen aller untersuchter Spezies die Expression von Gi-Proteinen bestätigt werden. Durch Vorbehandlung der Spermien mit oder ohne PTX, nachfolgende Membranpräparation und metabolischer Markierung konnte die Vermutung bestätigt werden, dass PTX während der Kapazitation nicht in der Lage war, Gi-Proteine zu ADP-ribosylieren und sie somit funktionell zu entkoppeln. Somit konnte festgestellt werden, dass die PTX-Behandlung von Spermien unterschiedlicher Spezies nicht in der Lage ist, eine funktionelle Entkopplung zu erzielen. Vermutlich ist das Toxin nicht in der Lage, die intakte Plasmamembran zu überwinden, und ist daher nicht geeignet, als zellbiologisches Werkzeug die Beteiligung von Gi-Proteinen an der Zona pellucida-induzierten Akrosomreaktion nachzuweisen. Unter mehreren charakterisierten ZP3-Rezeptoren soll die b-1,4-Galactosyltransferase Gi-Proteine aktivieren und dadurch zur Auslösung der AR beitragen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit lassen allerdings Zweifel daran aufkommen, ob die ZP3-vermittelte AR über G-Proteine das einzig annehmbare Modell sein kann. Vielmehr gewinnen durch die hier vorgestellten Befunde G-Protein-unabhängige Konzepte wie etwa eine p95 Tyrosinkinase oder Ca2+-permeable Ionenkanäle wie PKDREJ und PKD2L sowie PKD2L2 neue Bedeutung als Kandidaten für die durch Zona pellucida-Glykoproteine ausgelösten Signalmechanismen