Publikationsdatenbank

Kultivierung embryonaler Stammzellen der Maus unter serumreduzierten Kulturbedingungen mit und ohne Supplementierung eines Serumersatzes (2009)

Art

Hochschulschrift

Autor

Scholz, Patrick (WE 1)

Quelle

Giessen: VVB Laufersweiler, 2009 — X,109 Seiten

ISBN: 3-8359-5452-0

Verweise

URL (Volltext): https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/10013

Kontakt

Institut für Veterinär-Anatomie

Koserstr. 20
14195 Berlin
+49 30 838 75784
anatomie@vetmed.fu-berlin.de

Abstract / Zusammenfassung

Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) der Maus haben die Fähigkeit sich in Zellkultur nahezu unbegrenzt zu vermehren und sich unter geeigneten Kultivierungsbedingungen in die Zelltypen aller drei Keimblätter Mesoderm, Endoderm und Ektoderm zu entwickeln. Für die erfolgreiche in-vitro- Kultivierung von ES-Zellen ist es wichtig, die Umgebungsbedingungen der Zellen so weit wie möglich den in-vivo-Bedingungen dieses Zelltyps anzupassen. Dies gilt insbesondere für die Versorgung der Zellen mit einem geeigneten Medium und den entsprechenden Zusätzen. Als ein solcher Zusatz wird fötales Kälberserum (FBS) eingesetzt, das aus einer Vielzahl unterschiedlicher Komponenten besteht, die für das Wachstum und die Differenzierung der ES- Zellen essentiell sind. Da es sich hierbei um ein undefiniertes Naturprodukt mit hoher Chargenvariabilität handelt, dessen Gewinnung ethisch bedenklich ist, wird versucht ES-Zellen ohne den Zusatz von FBS zu kultivieren. Bisher ist es kaum gelungen, undifferenzierte embryonale Stammzellen der Maus effizient unter serumfreien Kulturbedingungen in schlagende Kardiomyozyten zu differenzieren. In der vorliegenden Arb eit wurde die Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus unter serumreduzierten Kulturbedingungen charakterisiert und ein zuvor etabliertes Gemisch von Supplementen auf seine Eignung als Serumersatz beurteilt. Dazu wurden zunä chst Endpunkte für die Untersuchung der in-vitro-Differenzierung von ES-Zellen zu Kardiomyozyten etabliert und auf die Praktikabilität und Redundanz ihres Informationsgehaltes überprüft. Dafür wurden die embryonalen Stammzellen über einen Zeitraum von zehn Tagen unter Standardkulturbedingungen (15 % FBS) kultiviert und an den Differenzierungstagen 5 bis 10 mit verschiedenen Methoden auf ihren Differenzierungsstatus untersucht. Neben der morphologischen Beurteilung der Zellen auf spontane Kontraktionen wurde die Differenzierung durch Markierung filamentärer Strukturen visualisiert und mittels Durchflusszytometrie und Genexpressionsanlyse quantifiziert. Als herzmuskelzellspezifisches Target diente hierzu Myosin heavy chain (MHC), welches sowohl mit der Immunzytochemie und in der FACS-Analyse auf Proteinebene, als auch in der Real Time PCR auf RNA Ebene nachzuweisen war. Im Gegensatz zur herkömmlichen mikroskopischen Auswertung bieten diese Methoden die Möglichkeit die ES-Zelldifferenzierung zu Kardiomyozyten zu einem früheren Zeitunkt zu erfassen, jedoch ließen sich objektive sowie reproduzierbare Ergebnisse nur mit der RT-PCR erreichen. Die Durchführung von an das Protokoll des Embryonalen Stammzelltest (EST) anlehnenden Proliferations-und Differenzierungstests, sowie die Anwendung der zuvor etablierten Messmethoden ermöglichte im zweiten Abschnitt die Untersuchung des Einflusses von serumreduzierten Kulturbedingungen mit und ohne Supplementierung eines Serumersatzes auf das Wachstums- und Differenzierungspotential der Stammzellen. Es konnte gezeigt werden, dass bei der serumreduzierten Kultivierung ohne Supplementierung mit einem Serumersatz mit abnehmender Serumkonzentration ein Rückgang der Differenzierung zu verzeichnen war. Diese Zellpopulationen zeigten Unterschiede in der Immunzytochemie, wiesen eine verminderte Kontraktilität sowie eine geringere Expression von MHC auf Protein- und RNA-Ebene auf. Darüber hinaus konnte jedoch bei einer Serumkonzentration von 2,5 % FBS mittels FACS-Analyse und Real Time PCR eine leichte Zunahme des Differenzierungsverhaltens der ES- Zellen beobachtet werden. Die Supplementierung mit einem als Serumersatz geltenden Gemisch aus Wachstumsfaktoren, Hormonen, Proteinen, Vitaminen, Spurenelementen und Antioxidantien ermöglichte die Kultivierung und Differenzierung von ES-Zellen zu Kardiomyozyten. Im Vergleich zum Standardkulturmedium (15 % FBS) zeigte sich mit 2 Tagen Verzögerung in der 24-Loch Funktionsanalyse eine maximale Kontraktilität. Immunzytologisch und durchflusszytometrisch konnten keine Unterschiede hinsichtlich der Differenzierung beobachtet werden. Eine Induktion kardialer α-MHC RNA wurde hingegen bei einem Restserumanteil von 0,5 % FBS detektiert. Relativiert zum Standardkulturmedium zeigte sich in diesen Testansätzen eine bis zu 7-fach höhere Expression. Schwächen hinsichtlich der Adhäsion und daraus resultierende Zellverluste spiegelten sich in den niedrigen Werten des Proliferationsverhaltens wieder. In dieser Studie erwies sich das Gemisch von Supplementen als geeignete Alternative zur Verwendung von fötalem Kälberserum für die Kultivierung von murinen embryonalen Stammzellen. Die Supplementierung definierter Bestandteile lässt embryonale Stammzellen unter nahezu serumfreien Kulturbedingungen zu Kardiomyozyten differenzieren. Eine daraus resultierende Serumreduktion von 15 % FBS auf lediglich 0,5 % FBS im Zellkulturmedium führt somit zu einer höheren Standardisierbarkeit und Reproduzierbarkeit in Testsystemen. Zu dem leistet dies einen wichtigen Beitrag zu einer besseren Vereinbarkeit von Ethik und Wissenschaft.