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Eignung unterschiedlicher Primer und DNA-Extraktionsmethoden zum PCR-Nachweis von Vertretern des Mycobacterium avium-intracellulare-Komplexes (MAIC) (2010)

Art

Hochschulschrift

Autor

Großpietsch, R

Quelle

Berlin: Mensch und Buch Verl, 2010 — III, 164 Seiten

ISBN: 978-3-86387-004-1

Verweise

URL (Volltext): http://www.diss.fu-berlin.de/diss/receive/FUDISS_thesis_000000024719

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Abstract / Zusammenfassung

Für eine effektive Überwachung und Bekämpfung der Mykobakteriose ist eine schnelle Detektion und spezifische Identifikation des Erregers erforderlich. Aufgrund des langsamen Wachstums von Mykobakterien kann dies aus der Kultur, die als „Goldstandard“ betrachtet wird, je nach Spezies mehrere Wochen dauern. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ermöglicht eine Amplifikation von DNA in wenigen Stunden und verkürzt somit die Dauer der Diagnostik beträchtlich.
Ziel dieser Arbeit war die Erarbeitung eines PCR-Modells als Grundlage für Reihenuntersuchungen von Schweinebeständen auf Vertreter des Mycobacterium avium-intracellulare-Komplexes (MAIC). In einem zweiteiligen Versuchsaufbau wurden in der Literatur beschriebene Primer und Zellaufschlussverfahren unter Verwendung von Mykobakterien-Stämmen vergleichend untersucht. Die Testung erfolgte zum einen an Verdünnungen von Reinkulturen bekannter Konzentration (Teil A), zum anderen an gespikten Lymphknotenproben (Teil B). Zum Einsatz kamen sechs Mykobakterien-Spezies/ Subspezies (M. intracellulare, M. avium subsp. avium, M. avium subsp. hominissuis, M. avium subsp. silvaticum, M. triviale, M. scrofulaceum), 10 Primerpaare und vier Zellaufschlussverfahren (Kochen, Chloroform/ Phenol-Methode, Ultraschall mit anschließendem Kochen, kommerzielles DNAExtraktionskit).
Mit den verwendeten Techniken war es möglich, Vertreter des MAIC nachzuweisen, wobei sich bei den Reinkulturen bessere Nachweisraten erzielen ließen als bei Vorhandensein von Lymphknotenmaterial.
Bei Reinkulturen (Teil A) erwies sich das alleinige Kochen der Probe als fast genauso effektiv wie die Ultraschallmethode mit anschließendem Kochen. Beim Routineeinsatz mit Mykobakterien-Kulturen kann deshalb die erstgenannte Methode empfohlen werden, da diese schneller durchzuführen, materialsparender und etwas kostengünstiger ist. Die Chloroform/ Phenol-Methode schnitt in Teil A schlechter ab als die beiden anderen Aufarbeitungsmethoden. Die durchschnittliche Nachweisgrenze betrug bei der Ultraschallmethode mit anschließendem Kochen 5,90 log10 KbE/ ml, beim Kochen 5,91 log10 KbE/ ml und bei der Chloroform/ Phenol-Methode 7,08 log10 KbE/ ml. Alle Primer waren bei Teil A in der Lage, die Mykobakterien, für die sie vorgesehen sind, aus der Bouillon zu detektieren.
Bei Vorhandensein von Lymphknotengewebe (Teil B) erwies sich die Kochmethode zur DNA-Extraktion als ungeeignet. Hier konnten die eingemischten Mykobakterien nur in 11 von 51 Verdünnungsreihen wiedergefunden werden (= 21,6 % positiv). Der Einsatz eines kommerziellen DNA-Kits (alle 51 Ansätze positiv) oder mit Abstrichen die Chloroform/ Phenol- Methode (48 von 51 Ansätze = 94,1 % positiv) erbrachte deutlich bessere Ergebnisse. Die Nachweisgrenze war beim DNA-Extraktionskit mit durchschnittlich 7,39 log10 KbE/ ml besser als bei der Chloroform-/ Phenol-Methode (7,95 log10 KbE/ ml), für das Kochen war eine Berechnung der Nachweisgrenze aufgrund der hohen Anzahl negativer Ergebnisse nicht möglich.
Als Primer zum Direktnachweis aus Lymphknotengewebe sollte die Kombination von AV 6/ 7 und IN 38/ 41 in Erwägung gezogen werden (Multiplex-PCR zum gleichzeitigen Nachweis von M. avium subsp. und M. intracellulare). Die Nachweisgrenze für den wichtigsten Vertreter M. avium subsp. hominissuis, der ca. 90 % aller Mykobakterien-Infektionen beim Schwein ausmacht, betrug mit dem Primer AV 6/ 7 in Kombination mit dem DNA-Kit 5,99 log10 KbE/ ml.
Die erzielten Nachweisraten waren im Vergleich zu den allgemein in der Literatur beschriebenen PCR-Nachweisraten unbefriedigend. Vor einem Einsatz im Feldversuch sollte deshalb durch Variation verschiedener Parameter eine Verbesserung der Nachweisrate angestrebt werden. Probenaufarbeitung, DNA-Extraktion und Durchführung der PCR sind gleichermaßen der Variation zu unterziehen.