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Entwicklung einer innovativen Strategie zur Generierung von knock-out-Mausmodellen (2004)

Art

Hochschulschrift

Autor

Christel, Cerstin Manuela (WE 11)

Quelle

Berlin: Mensch und Buch Verl., 2004 — 112 Seiten

ISBN: 3-89820-689-0

Verweise

URL (Volltext): https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/658

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Institut für Tierschutz, Tierverhalten und Versuchstierkunde

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Abstract / Zusammenfassung

Ziel dieser Arbeit war es, die Transkription spezifischer Zielgene mit Hilfe eines im Rahmen dieser Doktorarbeit neu zu entwickelnden Repressorsystems exogen induzierbar kontrollieren zu können (transcriptional targeting). In diesem Zusammenhang sollten neue und zuvor noch nicht funktionell im Tet-System getestete Repressorfusionen bezüglich ihrer Repressionseffizienz charakterisiert werden. In der hier vorliegenden Arbeit wurden deshalb sieben verschiedene Tet-Silencermoleküle (TetR (B/E)-HDAC 1,3 und 4; TetR (B/E)-MeCP2; TetR (B/E)-Dnmt3a; TetR (B/E)-Sin3A; TetR (B/E)-EED) generiert und zusätzlich ein Tet-abhängiges konstitutiv aktives HPRT-Responderkonstrukt hergestellt, welches als Reportergen Luciferase exprimierte. In einer ersten Versuchsreihe wurde das Potential der verschiedenen Tet-Repressoren zunächst in transienten Cotransfektionsessays evaluiert. Diese Experimente zeigten, dass der TetR (B/E)-HDAC 4-Repressor in der Lage war, die Luciferaseaktivität des HPRT-Responders um 50% herunterzuregulieren. Um die Effizienz des TetR (B/E)-HDAC 4-Repressors auf einem Zielpromoter zu testen, welcher im chromosomalen Kontext vorlag, wurde in weiteren Versuchen die HRL9-Zelllinie verwendet, welche einen konstitutiv aktiven humanen CMV-Minimalpromoter-Responder mit dem Reportergen Luciferase sowie einen reversen Transaktivator (rtTA) stabil in ihr Genom integriert hat. Mittels transienter Transfektion des TetR (B/E)-HDAC 4 in die HRL9-Zelllinie war es möglich, die Transkription des hCMV-Zielpromoters um über 60% zu reprimieren. Nach stabiler Transfektion der HRL9-Zelllinie mit dem TetR (B/E)-HDAC 4-Repressorkonstrukt wurden zwei Einzelklone isoliert, deren Luciferaseaktivität sich exogen über den Induktor Doxycyclin (DOX) im Medium sowohl negativ (durch HDAC 4-Repressorbindung) als auch positiv (durch rtTA-Transaktivatorbindung) regulieren ließ. Die mit Klon 102 durchgeführten Tet-on/off Induktionsversuche demonstrierten, dass die transkriptionelle Zielpromoteraktivität dieses Klons bei einem Konzentrationswechsel von 1μg/ml Medium zu DOX-freiem Medium um den Faktor 45 herunterreguliert werden konnte (shift rtTA-Transaktivatorbindung zu TetR (B/E)-HDAC 4-Repressorbindung am Zielpromoter). Weiterhin konnte innerhalb eines Langzeitversuches gezeigt werden, dass das reprimierende Potential der HDAC 4 Histondeacetylase auch nach sechswöchiger, ununterbrochener Anlagerung des Repressors an den hCMV-Promoter nicht zu einer permanenten Repression des Promoters führte. Dieses Resultat demonstrierte, dass die epigenetische Wirkung der Histondeacetylase 4 vollständig modulierbar bleibt und somit als dynamisch-reversibler molekularer "switch" funktioniert. Mit Hilfe des spezifischen Histondeacetylasehemmers Trichostatin A (TSA) konnte gezeigt werden, dass die beobachtete Repression auf die TetR (B/E)-HDAC 4-vermittelte Histondeacetylaseaktivität zurückzuführen war. Des weiteren gelang es im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe des tritransgenen stabilen HRL9-HDAC 4-Klons 102, grundlegende Einsichten über den funktionalen Zusammenhang zwischen Zellzyklusprogression und de novo Institution der Transkriptionsrepression bzw.-aktivation zu gewinnen. Durch die Blockade des Zellzyklus mit Hilfe von Mimosin konnte eindeutig bewiesen werden, dass die transkriptionelle Aktivation eines Zielpromoters (hCMV-Minimalpromoter) durch den reversen Transaktivator rtTA in der G1-Phase stattfinden kann. In Parallelversuchen gelang es erstmalig nachzuweisen, dass Histondeacetylase 4-vermittelte Genrepression nicht während der G1-Phase möglich war, sondern bei Progression durch den Zellzyklus (G1-S-G2-M-Transition) stattfinden muss. Die hier vorgelegten Daten demonstrierten daher erstmals eindeutig einen fundamentalen Funktionsmechanismus, nämlich wie und wann Transkriptionsrepression durch den Zellzyklus propagiert wird.