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Entwicklung eines IRS-Marker-Panels zur Erstellung einer integrierten physikalischen und genetischen Karte für das Rattengenom (2005)

Art

Hochschulschrift

Autor

Gösele, Claudia (WE 11)

Quelle

Gießen: DVG, 2005 — II, 116 Seiten

ISBN: 3-938026-50-2

Kontakt

Institut für Tierschutz, Tierverhalten und Versuchstierkunde

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Abstract / Zusammenfassung

The rat (Rattus norvegicus) is an important modelorganism in the molecular- biological research of complex human diseases. By midyear 1997 a multiplicity of clinical and phenotypical data were available for the rat, as opposed to a limited number of genomic resources. One aim of this thesis was the establishment of a hybridisation based IRS-Marker system for the rat genome. As a means markers were generated by the amplification of genomic sequence, located between a rat-specific interspersed repetitive sequence (IRS). IRS-PCR was combined with hybridisation based genetical and radiation hybrid (RH) mapping. Additionally corresponding YAC-clones were identified by hybridisation. In this part of the work the mapping of 351 IRS-Markers, generated from clones of a SHRSP-DNA derived IRS-PCR product library, proved to be a successful proceeding, one which is suitable for a high throughput approach. The IRS-Marker panel consists of 210 nonpolymorphic and 141 polymorphic markers, whose polymorphism patterns were determined for 38 different rat strains. 76 BN vs. SHRSP polymorphic markers from the IRS-Marker panel were genetically mapped onto a [ (SHRSP x BN) x BN ] backcross, among which 33 were also RH mapped markers. With the assignment of 308 IRS-Markers to both RH Framework maps these maps were integrated for the first time. In addition a physical framework map was built by the identification of IRS-Markers associated YAC-clones. Subsequently, in the context of this thesis, IRS-Markers should be applied for the construction of a comprehensive integrated map for the rat genome. For the construction of an integrated BAC/PAC/YAC map radiation hybrid mapping was combined with the strategy of "marker content linkage". IRS-PCR products were generated from individual BAC- and PAC-clones and their corresponding YAC- clones were identified. In all, RH positions of 5301 IRS-Markers were determined, by two methods: mapping on the RH framework maps and the TSP approach. The placements were subsequently integrated into one RH map. A contig map consisting of 605 YAC-contigs was constructed based on 31.757 overlapping YAC-clones. The linkage of the physical contig map with the RH map enabled the construction of a comprehensive map, with a confirmed contig order by the RH placement of several thousand IRS-Markers. The integrated BAC/PAC/YAC map consists of 23.512 unique YAC-clones linked to 5803 IRS-Markers. This map represents a 6,4-fold genome coverage and covers the vast majority of the rat genome. The combination of the integrated map and the rat genome sequence was achieved by constructing fingerprint and endsequence data from a set of 5361 IRS-Markers. Overall, 95% of the BAC/PAC/YAC map could be reliably linked to the rat genome sequence in agreement. The integrated map generated in the context of this thesis represents a comprehensive resource for the rat genome and allows direct access to the rat genome sequence.

Die Ratte (Rattus norvegicus) hat als Modellorganismus eine wichtige Funktion in der molekularbiologischen Erforschung von komplexen Erkrankungen des Menschen. Mitte 1997 standen für die Ratte eine Vielzahl klinischer und phänotypischer Daten zur Verfügung, jedoch nur eine begrenzte Anzahl an genomischen Ressourcen.
Ein Ziel dieser Arbeit war es, ein auf Hybridisierungen basierendes IRS-Markersystem für das Rattengenom zu etablieren.
Als Strategie hierfür wurden Marker durch die Amplifikation von genomischer Sequenz generiert, die zwischen Ratte-spezifischen eingestreuten repetitiven Sequenzen (IRS) liegt. Die IRS-PCR wurde mit auf Hybridisierungen basierender genetischer Kartierung und Radiation Hybrid-Kartierung kombiniert. Zusätzlich wurden mittels Hybridisierung korrespondierende YAC-Klone identifiziert.
In diesem Teil der Arbeit wurde mit der Kartierung von 351 IRS-Markern, generiert aus Klonen einer aus SHRSP-DNA erstellten IRS-PCR-Produkt-Bibliothek, gezeigt, dass dieses Vorgehen erfolgreich ist und mit hohem Durchsatz durchgeführt werden kann. Das IRS-Marker-Panel besteht aus 210 nicht-polymorphen und 141 polymorphen Markern, deren Polymorphismus Muster für 38 unterschiedliche Rattenstämme bestimmt wurde. Aus dem IRS-Marker-Panel wurden 76 BN vs. SHRSP polymorphe Marker genetisch auf einer [(SHRSP x BN) x BN] Rückkreuzung kartiert, 33 dieser Marker sind ebenfalls RH-kartiert. Durch die Platzierung von 308 IRS-Marker auf beide RH-Framework-Karten wurden diese RH-Karten erstmals integriert. Darüber hinaus wurde über die Identifizierung von YAC-Klonen, die mit IRS-Markern assoziiert sind, eine physikalische Rahmenkarte erstellt.
Weiterhin sollten im Rahmen dieser Dissertation IRS-Marker für die Konstruktion einer umfassenden integrierten Karte für das Rattengenom verwendet werden.
Für die Konstruktion einer integrierten BAC/PAC/YAC-Karte wurde die Kartierung über Bestrahlungshybride mit der Strategie des „marker-content linkage“ kombiniert. IRS-PCR-Produkte wurden von individuellen BAC- und PAC-Klonen generiert und deren korrespondierende YAC-Klone identifiziert.
Insgesamt wurden die RH-Positionen von 5301 IRS-Markern sowohl durch die Kartierung auf den RH-Framework-Karten, als auch über den TSP-Ansatz ermittelt und anschließend zu einer RH-Karte integriert.
Anhand von 31757 überlappenden YAC-Klonen wurde eine Contig-Karte aus 605 YAC-Contigs erstellt. Eine Verbindung der physikalischen Contig-Karte mit der RH-Karte ermöglichte die Erstellung einer umfassenden Karte, deren Contig-Abfolge über die RH-Kartierung von mehreren tausend IRS-Markern bestätigt wurde. Die integrierte BAC/PAC/YAC-Karte umfasst 23512 unique YAC-Klone, die mit 5803 IRS-Markern verbunden sind. Sie stellen eine 6,4fache Genomabdeckung dar und repräsentieren den Großteil des Rattengenoms.
Die Verbindung der integrierten Karte und der Rattengenomsequenz wurde durch ein Set von 5361 IRS-Markern ermöglicht, für das Fingerprint- und Endsequenzdaten erstellt wurden. Insgesamt konnten 95% der BAC/PAC/YAC-Karte in verlässlicher Übereinstimmung mit der Rattengenomsequenz verknüpft werden.
Die im Rahmen dieser Doktorarbeit generierte integrierte Karte stellt eine umfassende Ressource für das Rattengenom dar und ermöglicht einen direkten Zugriff auf die Rattengenomsequenz.