Fachbereich Veterinärmedizin


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    Etablierung von in vitro-Modellen der Angiogenese muriner und humaner Endothelzellen sowie deren Transfektion mit verschiedenen Plasmidkonstrukten (2003)

    Art
    Hochschulschrift
    Autor
    Lienau, Jasmin
    Quelle
    Berlin, 2003 — 236 Seiten
    Verweise
    URL (Volltext): http://www.diss.fu-berlin.de/diss/receive/FUDISS_thesis_000000001160
    Kontakt
    Institut für Veterinär-Anatomie

    Koserstr. 20
    14195 Berlin
    +49 30 838 53555
    anatomie@vetmed.fu-berlin.de

    Abstract / Zusammenfassung

    Angiogenese, die Neubildung von Blutgefässen, kommt physiologischerweise nur im Embryo und Fetus sowie beim Adulten im Rahmen zyklischer Prozesse im Ovar, in der Plazenta und bei der Entwicklung der Milchdrüse vor (Risau, 1997). Alle anderen Formen der Angiogenese sind mit pathologischen Prozessen, insbesondere dem Tumorwachstum, verbunden. Eine hoffnungsvolle und Erfolg versprechende Alternative zu bisherigen Strategien der Tumortherapie ist die gentherapeutische Anti-Angiogenese. Eine selektive Expression des Transgens von Endothelzellen kann dabei durch Einsatz von Endothelzell-spezifischen genregulatorischen Elementen erzielt werden. Die vorliegende Arbeit verfolgte zwei Hauptziele, nämlich die Etablierung und Charakterisierung von in vitro-Modellen der Angiogenese muriner und humaner mikrovaskulärer Endothelzellen sowie die Charakterisierung verschiedener Plasmidkonstrukte auf Effizienz in diesen Modellen. Im Rahmen der Transfektionsversuche sollten zusätzlich morphologische Veränderungen transfizierter Endothelzellen auf licht- und elektronenmikroskopischer Basis untersucht werden, um einerseits Aussagen über die Aufnahme der Transfektionskomplexe in die Zellen sowie deren Weg in den Zellkern zu machen und andererseits mögliche morphologische Schädigungen der Zellen infolge der Transfektion zu beurteilen und abzuschätzen.

    Analog zur in vivo-Angiogenese durchliefen die eingesetzten mikrovaskulären Endothelzellen, isoliert aus der Vorhaut von Neugeborenen sowie aus dem Myokard zwei Wochen alter Mäuse, durch Stimulation mit pro-angiogenen Faktoren verschiedene Stadien der angiogenen Kaskade in vitro. Initiiert wurde die angiogene Kaskade morphologisch durch eine vollständige bzw. partielle Konfluenz der Endothelzellen (Stadium 1). Es kam zur linearen und zirkulären Aneinanderreihung von Endothelzellen (Stadium 2) und schliesslich zur Ausbildung kapillarähnlicher Strukturen mit einem zentralen Lumen (Stadium 3 und 4). Die Endothelzellen bildeten ein basalmembranähnliches Material, welches interzellulär sowie in intrazellulären Vakuolen und im Lumen kapillarähnlicher Strukturen detektiert werden konnte. Die Lumenbildung erfolgte durch Ausbildung intrazellulärer Vakuolen sowie durch Apoptose. Wýhrend die eingesetzten murinen Endothelzellen planar zur Kulturschalenoberfläche kapillarähnliche Strukturen ausbildeten (zweidimensionales in vitro-Modell der Angiogenese), konnte mit den humanen Endothelzellen erstmals ein realitätsnahes, dreidimensionales in vitro-Modell der Angiogenese etabliert werden, in dem analog zur in vivo-Angiogenese die Ausbildung kapillarähnlicher Strukturen durch Degradation eines von den Zellen selbst sezernierten basalmembranähnlichen Substrates sowie Migration bzw. Invasion, Proliferation und Differenzierung erfolgte. Im basalmembranähnlichen Material wurde immunhistochemisch Kollagen IV identifiziert. Ein besonderer Befund dieser Arbeit, beobachtet im murinen Zellkulturmodell, war der zyklische Verlauf der in vitro-Angiogenese mit dazwischen liegender „Latenzzeit“. Nach dem Ablösen der kapillarähnlichen Strukturen von der Kulturschale konnte nach ca. 2 Monaten Kultivierung der auf der Kulturschale verbliebenen Endothelzellen ein erneutes Auftreten dieser Strukturen beobachtet werden. Interessant war, dass im zweiten Zyklus gerade die Zellen kapillarähnliche Strukturen ausbildeten, welche zuvor unbeteiligt an der Ausbildung dieser Strukturen waren. Die Ergebnisse indizieren, dass während der „Latenzzeit“ eine Differenzierung der Endothelzellen in einen angiogenen Phänotyp erfolgte.
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