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Evaluierung und Etablierung von Analyseverfahren zur Differenzierung der Spezies V. cholerae Non-O1/-O139 und V. mimicus mittels MALDI-TOF MS in einem Routinelabor der amtlichen Lebensmittelüberwachung (2023)

Art

Hochschulschrift

Autor

Vick, Stephanie (WE 8)

Quelle

Berlin: Mensch und Buch Verlag, 2023 — 154 Seiten

ISBN: 978-3-96729-221-3

Verweise

URL (Volltext): https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/40616

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Abstract / Zusammenfassung

Das Ziel dieser Arbeit war es, die nahe verwandten Spezies V. cholerae und V. mimicus mittels MALDI-TOF MS und den zur Verfügung stehenden Standard-Softwares (flexAnalysis, MALDI Biotyper OC) und deren Tools schnell und sicher zu differenzieren. Später war es möglich, eine weitere Software (ClinPro Tools) und eine zusätzliche Vibrio-spezifische Datenbank (VibrioBase) zu erhalten und diese in die Untersuchungen einzubinden. Zunächst wurden von 62 Vibrio-Isolaten 20 (zehn je Spezies) ausgewählt, um sie auf potentiell speziesdiskriminierende Peaks in der Software flexAnalysis zu untersuchen. Hier war eine interne Kalibrierung der Spektren auf einen gattungsgemeinsamen Peak (4279 Da) vorteilhaft, da sie einheitlich darauf ausgerichtet und Streuungen minimiert wurden. Auffällige Peaks mussten Auswahlkriterien standhalten, um als potentiell speziesdiskriminierend gewertet zu werden. Anschließend wurden diese Peaks anhand der bisherigen 20 und weiterer 42 Isolate validiert. Dabei ergab sich für V. cholerae eine Sensitivität von 97% und eine Spezifität von 100%, für V. mimicus waren es 93% und 97%. Mit den Anwendungen der Software MALDI Biotyper OC konnten keine diskriminierenden Peaks ermittelt werden. Allerdings konnten die Spezies mit der Dendrogramm- und PCA-Funktion gut voneinander unterschieden werden, sofern Kontrollisolate mitgeführt wurden. Parallel wurden von den 42 o.g. Isolaten sowohl Spektren mittels Direkttransfer (BRUKER DALTONIK GmbH, 2013b) als auch mit der Ameisensäure-Extraktion (BRUKER DALTONIK GmbH, 2013a) erstellt und verglichen. Dabei machte sich schnell bemerkbar, dass der Direkttransfer eine erhebliche Einsparung von Arbeitsaufwand, -mitteln und -zeit erbringt. Später wurde mit der Software ClinPro Tools festgestellt, dass sich die bisher gefundenen diskriminierenden Peaks hiermit sehr viel schneller ermitteln ließen. Besonders mit der Funktion, eigene Modelle zu generieren, ergäbe sich künftig mit dem Direkttransfer die Möglichkeit, ein Ergebnis für ein V. cholerae-mimicus-fragliches Isolat (von der Agarplatte bis zum Resultat) innerhalb von etwa 15 min zu erhalten. Allerdings hatte ClinPro Tools die Einschränkung, dass Spektren gleicher Isolate oder von sehr nahe verwandten Spezies, wie z.B. V. metoecus, nicht auffallen und nicht differenziert werden konnten. Bei dieser Problematik stellte sich flexAnalysis zwar als zeitintensiv, aber durch die sehr genaue Spektrenauswertung als geeigneter heraus. Zu einem nochmals späteren Zeitpunkt wurden weitere elf Isolate vom BfR zur Verfügung gestellt, bei denen in vorherigen Untersuchungen widersprüchliche Speziesergebnisse auftraten. Diese Isolate wurden in gleicher Weise, wie die Bisherigen untersucht. In allen drei verwendeten Softwares und deren Anwendungen erhielten sie das Ergebnis V. mimicus. Dies wurde später vom BfR über Genom-Sequenzanalysen bestätigt und es unterstützt die Anwendbarkeit der in dieser Arbeit untersuchten Differenzierungsmöglichkeiten nahe verwandter Bakterienspezies mittels MALDI-TOF MS. Zuletzt wurde die Datenbank VibrioBase in MALDI Biotyper OC hinzugefügt. Es sollte geprüft werden, ob sich mit ihr die untersuchten Spezies besser differenzieren ließen als mit den bisher verfügbaren Datenbanken (BDAL und SR). V. cholerae-Isolate wurden sowohl mit der VibrioBase (+ SR) als auch mit der Bruker BDAL-Datenbank (+SR) zu 100% richtig identifiziert. Die V. mimicus-Isolate wurden zu 89% richtig identifiziert und zu 11% falsch als V. cholerae oder nicht sicher. Wohingegen die BDAL-Datenbank (+SR) nur etwa 20% der V. mimicus-Isolate korrekt differenzieren konnte. Die in dieser Arbeit zufällig gefundenen Isolate der Spezies V. metoecus erhielten immer das falsche Ergebnis V. mimicus, da diese Spezies in den Datenbanken nicht hinterlegt war. Um künftig Routineisolate zügig zu differenzieren, wird empfohlen, V. cholerae-mimicus-fragliche Isolate zunächst per Direkttransfer aufzuarbeiten und mit Vibrio-spezifischen Datenbanken z.B. VibrioBase abzugleichen. Hat der Anwender keine solcher Datenbanken zur Verfügung, kann er eigene Modelle in ClinPro Tools mit den Peaks bei 4025 Da, 7969 Da und 9122 Da für V. cholerae und 7958 Da, 9141 Da, 9477 Da und 9981 Da für V. mimicus erstellen und die Isolate in kurzer Zeit klassifizieren. Andernfalls können diese Peaks selbst in flexAnalysis aufgesucht werden, nachdem die Spektren intern auf den Peak bei 4279 Da kalibriert wurden. Die Spezies V. metoecus konnte nicht differenziert werden, da nur zwei Isolate vorlagen. Allerdings kann ein erfahrener Anwender u.U. die Andersartigkeit dieser Spektren im Vergleich zu V. cholerae- und V. mimicus-Spektren erkennen. Um künftig bei weiteren Spezies mit sehr ähnlichen Spektren, z.B. V. metoecus, spezifische Peaks selbst zu ermitteln, wird empfohlen, die zu untersuchenden Isolate unter standardisierten Bedingungen anzuzüchten und mit der Ameisensäure-Extraktion aufzuarbeiten. Die Suche nach spezifischen Peaks sollte zunächst in ClinPro Tools erfolgen z.B. mit dem Total Average Spektrum, der Gelview Funktion, der ROC Analyse oder einer Kombination daraus. Anschließend können entsprechende Modelle generiert werden. Eine kurze Überprüfung in flexAnalysis sollte trotzdem erfolgen, um auffällige Isolate zu erkennen. Steht ClinPro Tools nicht zur Verfügung, ist ein visueller Abgleich in flexAnalysis auf alleinstehende Peaks oder Peakshifts möglich. Dabei sollte eine interne Kalibrierung aller Spektren z.B. auf einen gattungsspezifischen Peak erfolgen.