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Untersuchungen zur Interaktion kationischer Liposomen mit mikrovaskulären Endothelzellen in vitro unter besonderer Berücksichtigung der endothelialen Glykokalix und der liposomalen Zytotoxizität (2010)

Art

Hochschulschrift

Autor

Backhaus geb. Hansen, Sophie (WE 1)

Quelle

Berlin: Mensch und Buch Verlag, 2010 — XI, 125 Seiten

ISBN: 978-3-86664-847-0

Verweise

URL (Volltext): https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/13911

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Institut für Veterinär-Anatomie

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Abstract / Zusammenfassung

Liposomen waren in den letzten Jahren Fokus intensiver Forschungen und haben sich insbesondere als Vektoren im Rahmen des Drug Targeting etabliert. Für kationische Liposomen konnte eine Anreicherung in den Endothelzellen des Tumorgefäßbettes nachgewiesen werden, so dass sie im Rahmen eines neovaskulären Targetings zur antiangiogenen Tumortherapie intensiven Forschungen unterzogen wurden und werden. Ziel dieser Arbeit war es, die Aufnahme kationischer Liposomen durch proliferierende mikrovaskuläre Endothelzellen unterschiedlichen Ursprungs in vitro zu untersuchen, um Gemeinsamkeit und Unterschiede in der Prozessierung kationischer Liposomen zwischen Endothelzellen aus gesunden Organen und aus Tumoren aufzudecken. Die Glykokalix als Vermittler vieler zellulärer Aufnahmemechanismen sollte für die eingesetzten Endothelzellkulturen charakterisiert werden, um Hinweise zu erhalten, ob sie Einfluss auf die Aufnahme kationischer Liposomen haben könnte. Darüber hinaus deutete sich in den durchgeführten Versuchen zur qualitativen und quantitativen Untersuchung der Aufnahme an, dass die Liposomen ein zytotoxisches Potential besitzen. Aus diesem Grunde wurden Untersuchungen zur Induktion der Apoptose durch Inkubation kationischer Liposomen mit proliferierenden Endothelzellen durchgeführt, um dieses Phänomen näher zu charakterisieren. Zum Einsatz kamen Endothelzellen, die aus gesunden Organen isoliert worden waren (Endothelzellen aus dem bovinen Corpus luteum in Regression; BCl Rcobble), Endothelzellen aus der Haut eines Menschen; HMVEC) ebenso wie eine Endothelzellkultur, die spontan transformiert war (MHEC5, isoliert aus dem Herzmuskel einer Maus). Es wurden phasenkontrast-, fluoreszenz- und elektronenmikroskopische Untersuchungen zur Liposomeninkubation ebenso wie Apoptosetests nach Liposomeninkubation und spezielle Färbungen der Glykokalix für elektronenmikroskopische Untersuchungen durchgeführt. In diesen Studien wurde erstmals die Glykokalix der hier eingesetzten Endothelzellkulturen in vitro charakterisiert. An allen Zellen ließ sich die Glykokalix mit einer durchschnittlichen Höhe von 10-30 nm deutlich darstellen, jedoch unterschieden sich die Endothelzellen hinsichtlich der Ausprägung der Glykokalix. Die humanen Endothelzellen wiesen eine gleichmäßig hohe Glykokalix auf. Im Vergleich dazu war die Glykokalix muriner und boviner Endothelzellen an einigen Stellen von Konglomeraten überragt und somit unregelmäßig hoch und aufgeraut, in der Grundhöhe jedoch vergleichbar der Glykokalix humaner Endothelzellen. Diese aufgeraute Glykokalix trat insbesondere auf der luminalen Seite der Zellen an Zellausläufern auf. Am auffälligsten war, dass bei den bovinen Endothelzellen die Glykokalix stellenweise unterbrochen war, während sie bei den murinen und humanen Endothelzellen die Zellen vollständig umgab. Zur Untersuchung der Aufnahmemechanismen der Liposomen durch die Endothelzellen wurden markierte Liposomen für fluoreszenz- und elektronenmikroskopische Studien eingesetzt. In allen Studien wurden die Liposomen durch die eingesetzten Endothelzellen gebunden und internalisiert, jedoch waren Unterschiede zwischen den Kulturen auffällig. Quantitativ nahmen die murinen Endothelzellen, die spontan transformiert waren, am meisten kationische Liposomen auf, sie banden bis zu 10 Mal so viele Liposomen wie die humanen und die bovinen Endothelzellen. Zudem internalisierten sie 30-100 Mal so viele Liposomen wie die humanen und bovinen Endothelzellen, die aus gesunden Organen isoliert worden waren. Somit wurden durch die Endothelzellen eines Tumorgefäßbettes mehr Liposomen gebunden und internalisiert als durch Endothelzellen gesunden Ursprungs. Mit größerer Inkubationsdauer nahm die Internalisierung kationischer Liposomen in allen drei Endothelzellkulturen stetig zu. Dahingegen war die Bindung der kationischen Liposomen in den eingesetzten Kulturen im zeitlichen Verlauf unterschiedlich, die humanen Endothelzellen banden stetig mehr Liposomen, bei den bovinen Endothelzellen schwankte die Bindung und bei den murinen Endothelzellen wurde schnell ein Bindungsplateau erreicht, es gab im zeitlichen Verlauf keine vermehrte Bindung kationischer Liposomen. Internalisierte Liposomen in intrazellulären Vesikeln der Zellen waren sowohl elektronen- als auch fluoreszenzmikroskopisch aufzufinden, sie waren mittels Endozytose aufgenommen worden. Die bovinen Endothelzellen wiesen Liposomen an Caveolae auf, somit könnte hier eine Caveolae-vermittelte Endozytose für die Aufnahme verantwortlich sein. Bei den murinen Endothelzellen schien eine nicht-selektive Endozytose für die Internalisierung verantwortlich zu sein, es gab keine Anzeichen von Liposomen an Caveolae oder Clathrin-coated pits. Es sind also in den verschiedenen Endothelzellkulturen unterschiedliche Mechanismen der Endozytose für die Internalisierung verantwortlich. Somit konnte mit den hier verwendeten Endothelzellkulturen demonstriert werden, dass Endothelzellen unterschiedlichen Ursprungs auch Unterschiede in ihrer Interaktion mit den eingesetzten kationischen Liposomen aufweisen. Zudem fanden sich elektronenmikroskopisch Hinweise auf eine Fusion kationischer Liposomen mit der äußeren Zellmembran. Die Liposomen erreichten keine anderen Zellorganellen. Die Untersuchungen zur Apoptoseinduktion durch Inkubation mit kationischen Liposomen ergaben, dass einzig bei den murinen Endothelzellen eine gesteigerte Apoptoserate und das Auftreten von Nekrosen nach Liposomeninkubation beobachtet werden konnte. Dies legte die Vermutung nahe, dass einzig durch die murinen Endothelzellen ausreichend Liposomen aufgenommen wurden, um eine Zellschädigung zu verursachen. Für den Einsatz kationischer Liposomen im Rahmen des Drug Targeting in vivo bedeutet dies, dass die kationischen Liposomen die zytotoxische Wirkung eines transportierten Chemotherapetikums durch ihre eigene Zytotoxizität unterstützen können. Sollten Endothelzellen außerhalb des Gefäßbettes des Tumors vermehrt kationische Liposomen aufnehmen, so könnten auch gesunde Gewebe geschädigt werden.