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In-vitro- und in-vivo-Untersuchungen zur Effizienz verschiedener mikrobieller Phytasen als Futterzusatzstoff (2010)

Art

Hochschulschrift

Autor

Brünig, Paula (WE 4)

Quelle

Berlin: Mensch und Buch Verlag, 2010 — IX, 142 Seiten

ISBN: 978-3-86664-782-4

Verweise

URL (Volltext): https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/5423

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Abstract / Zusammenfassung

Zwei E.coli-Phytasen (Optiphos und FB-Phytase) wurden hinsichtlich ihrer biochemischen Fähigkeiten untersucht (pH-Verhalten, Temperaturverhalten und –stabilität sowie proteolytische Stabilität), um deren Eignung als Futterzusatzstoff zu überprüfen. Als Vergleichsenzym wurde die kommerziell erhältliche Aspergillus-Phytase Natuphos® hinzugezogen. Die Ergebnisse zum pH- Verhalten zeigen, dass die pH-Optima der untersuchten Enzyme im sauren Bereich liegen. Die E.coli-Phytasen weisen ihre pH-Optima bei 4,5 und 5,0 auf, während Natuphos® die optimale Wirkung bei pH 5,5 zeigt. Im neutralen pH-Bereich sind alle Enzyme inaktiv. Das Temperaturoptimum der Phytasen wurde ermittelt, indem die Enzyme bei acht unterschiedlichen Temperaturen zwischen 30°C und 80°C in Natriumacetatpuffer mit dem für das jeweilige Enzym optimalen pH-Wert für 60 Minuten inkubiert wurden. Die anschließenden Aktivitätsbestimmungen zeigten, dass die Termeraturoptima für beide E.coli-Enzyme bei 55°C und für die Aspergillus-Phytase bei 50°C liegen. Die Temperaturstabilität der Phytasen wurde für drei unterschiedliche Temperaturen und jeweils für eine Gesamtdauer von 120 Minuten bestimmt. Die Enzyme wurden in Natriumacetatpuffer mit dem jeweils optimalen pH-Wert inkubiert und anschließend die Phytaseaktivität gemessen. Die Temperaturstabilitätsmessungen in wässriger Lösung zeigen, dass Natuphos® von den drei getesteten Enzymen am stabilsten, Optiphos hingegen am wenigsten stabil ist. Schon bei 20-minütiger Inkubation bei 50°C weist die Optiphos-Phytase unter 10% Restaktivität auf, FB-Phytase und Natuphos® hingegen noch 60% respektive 80% Restaktivität. Die Phytasen wurden ferner hinsichtlich ihrer Hitzestabilität beim Pelletiervorgang untersucht. Hierbei wurde als Vergleichsenzym die Peniophora-Phytase ZY-Phytase hinzugezogen. Die zu einem Mischfutter für Broiler supplementierten Phytasen wurden beim Pelletieren vier unterschiedlichen Temperaturen zwischen 55°C und 85°C ausgesetzt. Das E.coli-Enzym Optiphos (in der granulierten Form) war die stabilere der beiden E.coli-Phytasen. Bei 85°C wies dieses Enzym eine Restaktivität von 77% auf. Auch das Vergleichsenzym Peniophora war unter diesen Bedingungen stabil (96% Restaktivität bei 85°C). Die FB-Phytase war sowohl in granulierter Formulierung als auch in Pulverform bei 85°C inaktiv, aber auch die Pulverform des Optiphos-Enzyms war bei 85°C nicht stabil. Um die Widerstandsfähigkeit der Phytasen gegenüber Proteasen zu testen, wurden die Enzympräparate für 20 Minuten in wässriger Pepsin- bzw. Pankreatinlösung bei 40°C inkubiert. Die Ergebnisse zeigten, dass das Vergleichsenzym Natuphos® empfindlich gegenüber Pepsin, besonders aber gegenüber Pankreatin ist. Optiphos verlor in beiden Medien etwa 45% der Aktivität und ist somit nur mäßig stabil gegenüber proteolytischer Inaktivierung. FB-Phytase ist relativ unempfindlich gegenüber Inaktivierung durch Pepsin (etwa 74% Restaktivität), jedoch empfindlich gegenüber Pankreatin. Auch wurde der Einfluss von Digestaüberstand auf die Enzyme untersucht. Die Inkubationen erfolgten bei 40°C für 60 Minuten in der Digestalösung aus dem Magen und proximalem Jejunum vom Schwein. In der Magendigesta mit einem pH-Wert von 5,05 waren sowohl die Aspergillus-Phytase als auch die E.coli-Phytasen stabil. In der Jejunaldigesta (pH-Wert 6,34) waren die E.coli-Phytasen Optiphos und FB-Phytase mit Restaktivitäten von 35% und 38% eher instabil, Natuphos® zeigte hingegen mit 70% Restaktivität eine akzeptable Stabilität. Der Weg und die Effizienz des Substratabbaus der Aspergillus-, E.coli- und Bacillus-Phytasen wurden durch Inositolphosphatbestimmung mittels HPLC untersucht. Für jedes der zu prüfenden Enzyme wurde eine Enzymlösung hergestellt und diese mit Substratlösung (Natriumphytat) für unterschiedliche Zeiten (15, 45, 90 und 120 Minuten) bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Reaktion der Phytase gestoppt und die Inositolphosphatbestimmung mittels HPLC durchgeführt. Es konnte für die Aspergillus-Phytase ein Hauptabbauweg des Substrates über das 1,2,4,5,6-IP5 und das 1,2,5,6-IP4 bis zum 1,2,5-IP3 gefunden werden. Für das E.coli-Enzym Optiphos wurde mittels HPLC ein Weg des Substratabbaus vom IP6 zum 1,2,3,4,5-IP5 und dann über das 2,3,4,5-IP4 zum 2,4,5-IP3 gefunden. Der Abbauweg der Bacillus amyloliquefacens-Phytase konnte wie folgt dargestellt werden: IP6, 1,2,4,5,6-IP5, 2,4,5,6-IP4. Die E.coli-Phytase war von den drei untersuchten Enzymen am schnellsten und am effizientesten beim Substratabbau: schon nach 90 Minuten war das Substrat komplett abgebaut und auch das Abbauprodukt IP5 war nicht mehr vorhanden. Weder die Aspergillus- noch die Bacillus-Phytase konnten IP6 komplett abbauen, zudem fand der Substratabbau deutlich langsamer statt als bei der E.coli-Phytase. Um die Möglichkeit einer Synergie zwischen der Optiphos- und der Bacillus-Phytase hinsichtlich des Phytatabbaus zu prüfen, wurden diese beiden Enzyme nacheinander zum Phytatabbau eingesetzt und das Ergebnis anschließend durch die Bestimmung der Inositolphosphate im HPLC untersucht. Zunächst wurde das Enzym Optiphos für 60 Minuten mit Natriumphytat inkubiert, anschließend die Reaktion gestoppt und dieselbe Probe mit dem Bacillus-Enzym nochmals für 45 respektive 90 Minuten inkubiert. Beim Abbau des Substrates konnten durch kombinierten Einsatz der E.coli- und Bacillus-Phytase deutliche Verbesserungen gezeigt werden: Beide Phytasen agierten in diesem Versuch synergistisch und konnten somit den Phytatabbau im Vergleich zur Wirkung einer einzelnen Phytase optimieren. Die in-vivo-Studie wurde konzipiert, um den dosisabhängigen Effekt von Optiphos in den hauptsächlich aus Mais und Optigrain bestehenden Diäten für Ferkel zu bestimmen. Die Diäten hatten eine marginale Ca- und P-Versorgung und wurden während der sechswöchigen Fütterungsperiode (24.-65. Lebenstag der Ferkel) ohne oder mit Phytasesupplementierung zu der Basaldiät mit den Enzymen Optiphos (bakterieller Ursprung aus E.coli) und Natuphos® (pilzlicher Ursprung aus Aspergillus niger) in Dosierungen von 125, 250, 500 und 1000 FTU/kg Futter verabreicht. Das Fütterungsexperiment hatte zum Ziel, die Effizienz der bakteriellen E.coli-Phytase in abgestuften Konzentrationen auf verschiedene Leistungsparameter im Vergleich zur pilzlichen Phytase oder der Negativkontrolle ohne Enzymsupplementierung einschätzen zu können. Die untersuchten Leistungsparameter waren Wachstum, Gewichtszunahme, Futteraufwand, Kotkonsistenz sowie die scheinbare Verdaulichkeit mit Fokus auf Kalzium, Phosphor und Rohasche. Das E.coli-Enzym Optiphos war im Fütterungsversuch im Hinblick auf Leistung und scheinbare Verdaulichkeit ebenso effektiv wie das kommerziell erhältliche Natuphos®: Der positive Effekt auf die Gewichtszunahme war sowohl bei Natuphos® als auch bei Optiphos am ausgeprägtesten während der dritten bis sechsten Woche des Experiments. Beide Enzyme zeigten einen gleichermaßen positiven Einfluss auf die Gewichtszunahme bei Absatzferkeln. Im Vergleich zur unsupplementierten Diät konnte der Zusatz von 1000 FTU/kg von Optiphos und Natuphos® die Futteraufnahme signifikant erhöhen. Die Ergebnisse der Bestimmung des MCP-Äquivalents zeigen, dass bis zum Level von 500 FTU/kg Optiphos effizienter ist und im Gegensatz dazu Natuphos® bei einem Gehalt von 1000 FTU/kg überlegen ist. Bei Zugabe niedrigerer Mengen unterhalb von 1000 FTU/kg ist Optiphos bei der Verbesserung der P-Verdaulichkeit überlegen (das optimale Level ist die Zugabe von 800 FTU/kg).