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Untersuchungen molekularer Mechanismen des Übergangs von Rindereizellen zu Embryonen (2011)

Art

Hochschulschrift

Autor

Siemer, Corinna (WE 3)

Quelle

Berlin: Mensch und Buch Verlag, 2011 — 133 Seiten

ISBN: 978-3-86664-963-7

Verweise

URL (Volltext): https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/11759

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Institut für Veterinär-Biochemie

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Abstract / Zusammenfassung

Die In-Vitro-Produktion (IVP) von Embryonen ist ein Standardverfahren der Tierzucht vor allem beim Rind. Trotzdem liegen die Blastozystenraten bei Oozyten mit morphologisch guter Qualität nur zwischen 30 und 40%. Besonders während der meiotischen Endreifung der Eizellen und der frühen Embryonalentwicklung werden entscheidende Grundlagen für die weitere Entwicklungsfähigkeit des Embryos gelegt. Am Beginn der Eizellendreifung wird durch die Kondensation des Chromatins die Transkription fast vollständig eingestellt. Trotzdem findet sich vermehrt polyadenylierte mRNA, die jedoch kaum translatiert wird. Stattdessen ist in MII-Eizellen die Translation stark reprimiert. Damit kommt es zur Akkumulation translatorisch inaktiver mRNAs, die dem frühen Embryo vor Einsetzen der eigenen Transkription spezifisch aktivierbar zur Verfügung stehen. An diesem Punkt ist eine Regulation nur noch auf der Ebene der Translation möglich. Limitierend für die Proteinsyntheserate und zentraler Ansatzpunkt der Regulation ist dabei die Translationsinitiation. Von Bedeutung sind hierbei vor allem verschiedene Initiationsfaktoren und andere 5´- und 3´- interagierende Proteine und die diese kontrollierenden Kinasen. Es soll bewiesen werden, dass stadienspezifische Veränderungen im Auftreten und der Phosphorylierung dieser Faktoren für die Repression der Translation in MII-Eizellen und deren Reaktivierung im frühen Embryo verantwortlich sind. Die wichtigsten Faktoren wurden im Rahmen dieser Arbeit anhand von in vitro gereiften bovinen Oozyten und Embryonen hinsichtlich ihres Vorkommens und ihrer Phosphorylierung im Verlauf der Eizellreifung und frühen Embryonalentwicklung mittels SDS-PAGE, Isoelektrischer Fokussierung, Western Blot und Immunopräzipitation analysiert. Dazu gehörten der eIF4F-Komplex mit dem Cap-Bindungsprotein eIF4E, dem Gerüstprotein eIF4G und der Helikase eIF4A, außerdem der Translationsrepressor 4E-BP1. Zu den 3´-interagierenden Proteinen gehörten PABP1 und 3; Paip1 und 2, CPEB1 und Maskin. Als verantwortliche Kinasen wurden MAPK, Akt und Aurora A und B untersucht. Auf der Grundlage des „Closed Loop“-Modells von Mangus et al. (2003) ergibt sich daraus folgende stark vereinfachte Darstellung der Translationsinitiation: Das Cap- Bindungsprotein eIF4E bindet an die Cap-Struktur am 5´-Ende der mRNA. Durch Aurora A phosphoryliertes Cytoplasmic Polyadenylation Binding Protein CPEB rekrutiert mittels CPSF (cleavage and polyadenylation specifity factor) die Poly(A)-Polymerase, die den Poly(A)-Schwanz verlängert. Daran kann das Poly(A)-Bindungsprotein binden. Die Bildung des eIF4F-Komplexes durch Bindung des Gerüstproteins eIF4G an 4E bringt die RNA-Helikase eIF4A in Position, so dass diese Sekundärstrukturen der mRNA auflösen kann und damit die Bindung des 43SPräinitiationskomplexes ermöglicht. Nur all diese Proteininteraktionen gemeinsam stimulieren die Translation. Dies bietet viele Möglichkeiten der Translationsreprimierung. So kann am 5´- Ende das hypophosphorylierte 4E-BP 1 oder vom 3´- Ende der CPEB-Maskin-Komplex an eIF4E binden und damit über Blockade der Bildung des eIF4F-Komplexes die Helikaseaktivität verhindern. Gerade am Übergang der Eizelle zum Embryo dominieren jedoch spezifische Mechanismen. Es konnte durch unsere Untersuchungen gezeigt werden, dass gerade im Übergang von der MII-Phase zum Zweizellstadium die deutlichsten Veränderungen in Auftreten und Phosphorylierung der beteiligten Faktoren zu finden sind. Darüber hinaus wurde gerade in der MII-Phase die stärkste Phosphorylierung spezifischer Zielsequenzen der Kinasen PKA, PKB, PKC, CDKs, ATM/ATR und MAPK nachgewiesen. Bei der Betrachtung der einzelnen Phasen fällt auf, dass im GV-Stadium die von somatischer Translation bekannten Repressoren wie 4E-BP1 und Paip2 deutlich verringert werden und dafür ein neuer hemmender Faktor in Aktion tritt, der im Verlauf dieser Arbeit entdeckt und erstmals beschrieben wurde. Auf der Suche nach einem dem Repressor Maskin ähnlichen Faktor wurde mittels des Maskin-Antikörpers bei bovinen Eizellen ein Protein gefunden, das zwar mit 55kDa deutlich kleiner ist, aber ebenso eIF4E- Bindungsfähigkeit besitzt und eine „Coiled Coil“-Domäne aufweist. Nur die Bindung mit CPEB konnte nicht nachgewiesen werden. Aber es zeigt sich eindeutig, dass das Protein gerade im GV-Stadium die eIF4EBindung an das Cap blockiert und damit die Bildung des eIF4F-Komplexes reprimiert. Während der weiteren Endreifung findet sich jedoch immer mehr hoch phosphoryliertes Maskin-Like-Protein im Durchlauf, so dass dies nicht die Hauptursache für die Translationsrepression im MII-Stadium sein kann. Eine Verkettung verschiedener Mechanismen verhindert in diesem Stadium die Translationsinitiation. Wichtigstes Element scheint die Degradation von CPEB in diesem Stadium zu sein. Dadurch wird weniger CPSF und folglich auch weniger Poly(A)-Polymeraseaktiviert, die mRNAs werden nicht polyadenyliert. PABP, das insgesamt nur in geringerer Menge in diesem Stadium vorkommt, kann dadurch kaum noch an den kurzen Poly(A)- Schwanz der mRNA binden. Damit steht es nicht für den Ringschluss der mRNA vermittelt durch das Gerüstprotein eIF4G zur Verfügung. Zudem wird eIF4G dephosphoryliert. Gemeinsam mit der fehlenden PABP-Bindung führt dies zu verminderter Affinität zum Cap- Bindungsprotein eIF4E, das zunehmend phosphoryliert wird. Der eIF4F-Komplex kommt damit nur schwach und in geringer Menge zustande, die Aktivität der Helikase eIF4A wird nicht ausgelöst. Damit kann der ribosomale Präinitiationskomplex nicht an die mRNA binden, die Translation unterbleibt. Im frühen Embryo bis zum Vierzeller kehren die Faktoren schrittweise zu einem Status zurück, der den wenigen frühen, nicht CPE-gesteuerten mRNAs die Translation ermöglicht. Die Phosphorylierung von eIF4G steigt wieder an, die des Cap-Bindungsproteins sinkt auf ein mittleres Niveau. Damit wird die Bildung der eIF4F-Komplexe wieder erleichtert. Der Repressor 4E-BP1 weist mittlere Phosphorylierung auf. So ist er noch nicht aktiv, kann aber sehr schnell voll aktiviert werden. Das Maskin-Like-Protein kommt zunächst nur in geringen Mengen vor, steigt dann im Acht- und Sechzehnzeller. In dieser Phase steigt das Vorkommen von CPEB und PABP deutlich an. Dies führt zur Reinitiation auch der Translation der großen Masse CPE-abhängiger mRNAs. In dieser Arbeit konnten Grundzüge der Translationsregulation am Übergang der Eizelle zum Embryo geklärt werden, es bleiben jedoch noch viele Fragen offen. Vor allem die Rolle des Maskin-Like- Proteins, Regulationsmechanismen der Translation früher mRNAs und die unterschiedlichen Gruppierungen der spät translatierten mRNAs bedürfen noch weiterer Untersuchungen.