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Identification of ZDHHC enzymes catalyzing acylation of influenza virus Hemagglutinin (2020)

Art

Hochschulschrift

Autor

Gadalla, Mohamed Rasheed Abdelalim Mohamed (WE 5)

Quelle

Berlin: Mensch & Buch Verlag Berlin, 2020 — VIII, 117 Seiten

ISBN: 978-3-96729-040-0

Verweise

URL (Volltext): https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/27230

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Abstract / Zusammenfassung

Influenzaviren sind negativsträngige, segmentierte und umhüllte RNA-Viren, die mit zwei Oberflächen-Peplomeren bedeckt sind: dem trimeren Hämagglutinin (HA), das den Viruseintritt durch Bindung an Sialsäure-haltige Rezeptoren und durch Fusion von Viren mit endosomalen Membranen katalysiert und der Neuraminidase (NA) die für die Freisetzung von Viruspartikeln aus infizierten Zellen benötigt wird. Unter den Influenzavirus-Proteinen sind nur HA und der Protonenkanal M2 ortsspezifisch mit Fettsäuren (S-acyliert) modifiziert, was für die Virusreplikation essentiell ist. Während zwei Cysteine in der kurzen zytoplasmatischen Schwanz von HA nur Palmitat enthalten, ist Stearat ausschließlich an ein Cystein gebunden, das sich nahe der zytoplasmatischen Grenze der Transmembranregion (TMR) befindet. M2 wird an einem Cystein palmitoyliert, das sich in einer amphiphilen Helix in der Nähe des TMR befindet. Die Enzyme, die die Acylierung von HA und M2 katalysieren, wurden nicht identifiziert, aber Mitglieder der ZDHHC-Enzymfamilie, die zelluläre Proteine acylieren, sind offensichtliche Kandidaten. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Expression von 23 Mitgliedern der ZDHHC-Familie in menschlichen Lungenzellen mittels qPCR analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass alle ZDHHCs (außer ZDHHC19) exprimiert werden. Interessanterweise wurde ZDHHC22 während einer Influenzavirusinfektion hochreguliert, was darauf hindeutet, dass es an der Acylierung viraler Proteine beteiligt sein könnte. Das CRISPR / Cas9-vermittelte Knockout von ZDHHC22 wirkte sich jedoch nicht auf die Acylierung sowohl von intrazellulär exprimiertem HA als auch von M2 aus, wie durch Acyl-RAC- und Klick-Chemie sowie HA in Viruspartikeln nachgewiesen wurde, wie durch MALDI-TOF-MS-Analyse gezeigt. Ich bestätigte jedoch, dass ZDHHC22 eine Acyltransferase ist, indem ich eine LC / MSVergleichspalmitomanalyse durchführte, bei der mehr als 50 Proteine als Substrate von ZDHHC22 identifiziert wurden. Darüber hinaus identifizierte ich das nichtstrukturelle Protein 1 (NS1) als auslösenden Faktor für die ZDHHC22-Hochregulation während einer Influenza-Infektion unter Verwendung von Expressionsvektoren und Virus-Deletionsmutanten. Im zweiten Teil habe ich erstmals 4 ZDHHC-Enzyme identifiziert, die an der Acylierung von Hämagglutinin (HA) beteiligt sind. Für das Screening verwendete ich eine siRNA-Bibliothek, um die Expression von jedem der 23 humanen ZDHHCs in HA-exprimierenden Hela-Zellen auszuschalten. siRNAs gegen ZDHHC2 und 8 hatten den stärksten Effekt auf die Acylierung von HA, wie es durch Acyl-RAC gezeigt und durch 3H-Palmitat-Markierung bestätigt wurde. Der anschließende CRISPR / Cas9-Knockout von ZDHHC2 und 8 in HAP1-Zellen, aber auch der phylogenetisch verwandten ZDHHCs 15 und 20 reduzierte die Acylierung von HAs der Gruppen 1 und 2 und von M2 stark. Einzelne ZDHHCs weisen jedoch geringfügig unterschiedliche Substratpräferenzen auf. Diese ZDHHCs lokalisieren in einer menschlichen Lungenzelllinie zusammen mit HA an Membranen des Exozytoseweges. ZDHHC2, 8, 15 und 20 werden für die Acylierung des Hämagglutinin-Esterase-Fusionsproteins des Influenza CVirus, das nur Stearat an einer Transmembran-Cystein enthält, nicht benötigt. Überraschenderweise beeinträchtigte das Knockout dieser ZDHHCs auch nicht die Acylierung von HA des Influenza B-Virus, das zwei palmitoylierte Cysteine in seinem cytoplasmatischen Schwanz enthält.