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Ein neuer Kreuzbandersatz:
Tissue Engeneering (2019)

Art

Hochschulschrift

Autor

Van Staa, Meike (WE 20)

Quelle

Berlin: Mensch und Buch Verlag, 2019 — X, 155 Seiten

ISBN: 978-3-96729-002-8

Verweise

URL (Volltext): https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/27196

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Abstract / Zusammenfassung

Der kraniale Kreuzbandriss des Hundes ist eines der häufigsten orthopädischen Erkrankungen und spielt dementsprechend in der modernen Tiermedizin eine wichtige ökonomische Rolle. In der Literatur sind über 120 unterschiedliche Therapieoptionen und -modifikationen beschrieben. Es wird zwischen intra- und extraartikulären sowie dynamischen Stabilisierungstechniken unterschieden. Während in der Humanmedizin der intraartikuläre Kreuzbandersatz der Goldstandard ist, ist es in der Veterinärmedizin zum aktuellen Zeitpunkt die TPLO – ein dynamisches Osteotomieverfahren. Das differenzierte Vorgehen liegt in der unterschiedlichen Ätiopathogenese und dem postoperativen Management sowie der unterschiedlichen Anatomie und Konfiguration des Kniegelenks bei Mensch und Hund begründet. Ziel ist eine Stabilisierung des Kniegelenkes zur Minimierung weiteren Verschleißes und zur Wiederherstellung der Funktionalität. In der Veterinärmedizin wurde bisher noch kein Transplantat gefunden, das in der Lage ist, das native Kreuzband zu ersetzten. Idealerweise muss es die identischen biomechanischen und physiofunktionellen Eigenschaften aufweisen und darf während des Einheilungsprozesses keiner Lockerung und Schwächung erfahren. Außerdem muss die immunologische Inertie gewährleistet sein. Fortschritte im Bereich des Tissue Engineering schaffen Möglichkeiten, die bisher existierenden Defizite auszugleichen und einen intraartikulären Ersatz des nativen Bandes zu optimieren. Beim Tissue Engineering werden Zellen, ein Trägergerüst und bioaktive Moleküle verwendet, um verletztes Gewebe zu reparieren oder ersetzen. Als Trägergerüst wurden equine und canine Sehnen verwendet, da sie ähnliche biomechanische und physiologische Eigenschaften wie das native Kreuzband aufweisen. Der strukturelle Aufbau unterscheidet sich nur geringfügig und die Immunogenität kann durch Entfernung zellulärer Bestandteile ausreichend reduziert werden. Dazu wurden die Sehnen über Nacht in destilliertem Wasser gewaschen und dann fünf Gefrier-Auftauzyklen (2 Minuten in flüssigem Stickstoff; 10-minütige Auftauphase im 37 °C warmen Wasserbad) durchgeführt. Anschließend erfolgte die Zugabe von 1%igem Triton bzw. 1%igem TnBP über 24 Stunden. Der Zelldebris wurde durch Zugabe von DNase bei 37 °C über Nacht entfernt. Nach mehreren Waschvorgängen wurden die Sehnen bei - 80 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert. Parallel wurden mesenchymale Stromazellen aus caninem Fettgewebe gewonnen und als ASCs charakterisiert. Dazu wurden die Zellen durch Zentrifugation, Kollagenaseverdau und Sieben aus dem Fettgewebe isoliert und anschließend kultiviert. Die ASCs der 3. und 4. Passage wurden durch Zugabe von Differenzierungsmedium in osteo-, adipo- und chondrogene Linie differenziert. Der Nachweis der Osteogenese erfolgte mikroskopisch durch Färbung der gebildeten Kalziumoxalate mit Alizarin Red und quantitativ mittels Absorptionsspektroskopie. Bei der Adipogenese wurden die Fettvakuolen mikroskopisch durch Färbung mit Oil Red O nachgewiesen. Die Chondrogenese wurde in zwei- und dreidimensionaler Kultur durchgeführt und der Nachweis erfolgte histologisch durch die Alician-Blau-Färbung der gebildeten Proteoglykane. Charakterisiert wurden die ASCs weiterhin durch den Nachweis spezieller Oberflächenmarker in der Durchflusszytometrie. Anschließend wurde eine Co-Kultivierung der ASCs mit den dezellularisierten Sehnen durchgeführt, um die Viabilität zu beurteilen. Zum Schluss fand die Rezellularisierung der Sehnen mit ASCs statt und das immogene und antiinflammatorische Potenzial wurde untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass beide verwendeten Protokolle (Triton X-100 und TnBP) zelluläre Bestandteile effektiv aus dem kompakten Sehnenmaterial entfernen, ohne die native Struktur wesentlich zu schädigen. Histologisch waren die dezellularisierten Sehnen frei von Zellen. Lediglich im Peritendineum ist vereinzelt Zelldebris nachweisbar. Die Sehnen wiesen einen deutlich reduzierten DNA-Gehalt im Vergleich zur nativen Sehne auf. Es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen der Dezellularisierung mit Triton X-100 und TnBP nachgewiesen werden. Weiterhin hatten dezellularisierte Sehnen einen vergleichbaren Glykosaminoglykan- und Kollagengehalt wie native Sehnen. Bei Testung der Immunogenität konnten nach umfangreicher Optimierung der Dezellularisierung keine signifikanten Interleukin-Anstiege im Vergleich zur Negativkontrollgruppe festgestellt werden. Andererseits konnte gezeigt werden, dass der IL-1-Anstieg im Vergleich zur Positivkontrollgruppe signifikant reduziert war. Wenn die Dezellularisierungsgruppe in die beiden Protokolle aufgeteilt wurde, gab es kaum einen Unterschied zwischen Triton X-100 und TnBP. Aus caninem Fettgewebe konnten erfolgreich mesenchymale Stromazellen isoliert und passagiert werden. Die caninen ASCs zeigten Plastikadhärenz und positives Proliferationsverhalten. Sie konnten in osteogene, adipogene und chondrogene Linien differenziert werden und weisen charakteristische Oberflächenmarker auf. Sie sind CD29-, CD44-, CD90- und CD105-positiv und CD14-, CD45- und MHCII-negativ. Eine Co-Kultivierung von ASCs und dezellularisierten equinen und caninen Sehnen hatte keinen negativen Effekt auf die Viabilität der Zelle, sondern zeigte einen positiven Trend. Histologisch konnte nachgewiesen werde, dass sich equine und canine dezellularisierte Sehnen mit caninen ASCs rezellularisieren lassen. Positiv sticht die Tatsache heraus, dass die Zellen auch einen Zellmantel ähnlich des nativen Synoviums um die dezellularisierte Sehne formen. Die Immunogenität der rezellularisierten Sehnen lag deutlich unterhalb der Positivkontrolle. Die Ergebnisse zeigen, dass das gewählte Modell für die Herstellung eines neuen Kreuzersatzbandes vielversprechende Ergebnisse liefert. Eine Optimierung der homogeneren Verteilung und besseren Ausrichtung der Zellen könnte mithilfe der Verwendung eines Bioreaktors erfolgen. Da die Sehnen jedoch wenige Tage nach der Rezellularisierung ins Tier eingebracht werden sollen und somit in einen natürlichen Bioreaktor eingepflanzt werden, besteht keine zwangsläufige Notwendigkeit. Dafür sind weitere Untersuchungen notwendig.