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Identifizierung und Charakterisierung von P-Glykoproteinen in kleinen Strongyliden (2018)

Art

Hochschulschrift

Autor

Kaschny, Maximiliane (WE 13)

Quelle

Berlin: Mensch und Buch Verlag, 2018 — X, 173 Seiten

ISBN: 978-3-86387-910-5

Verweise

URL (Volltext): https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/22841

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Institut für Parasitologie und Tropenveterinärmedizin

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Abstract / Zusammenfassung

Auf Grund hoher Prävalenz, weit verbreiteter Anthelminthikaresistenz (AR) und ausgeprägter Pathogenität der dritten und vierten Larvenstadien gehören Cyathostomine bzw. kleinen Strongyliden zu den bedeutendsten Infektionserregern des Pferdes. Resistenzen traten als erstes gegenüber den Benzimidazolen (BZ) auf, die bereits seit mehr als 20 Jahren nicht mehr uneingeschränkt für die Therapie empfohlen werden. Makrozyklische Laktone (ML) werden heute am häufigsten für die Behandlung von mit Cyathostominen infizierten Pferden angewendet. Während die Wirksamkeit der ML gegenüber kleinen Strongyliden trotz ihres intensiven Einsatzes in Europa kaum eingeschränkt ist, fanden Untersuchungen erste MLresistente Populationen in Südamerika (Brasilien). Die Expression von P-Glykoproteinen (Pgp) mit ihrer Fähigkeit Xenobiotika aus dem Zellinneren zu exportieren, wurde in Nematoden wie Haemoncus contortus und Teladorsagia circumcincta mit einer erhöhten Toleranz gegenüber ML in Verbindung gebracht. Die hier vorgestellte Studie untersuchte das Vorkommen und die funktionelle Bedeutung von Pgps in kleinen Strongyliden. Dabei konnten vollständige cDNA-Sequenzen des Pgp-Isotyps 3 in den Spezies Cylicocyclus elongatus, Cylicocyclus insigne und Cylicostephanus goldi mittels RT-PCR identifiziert werden. Für C. elongatus war zusätzlich die vollständige Amplifizierung und Sequenzierung von Pgp-9 möglich. Während die Ähnlichkeit der Pgp-3 cDNAs der Cyathostominen untereinander bei > 90 % lag, stimmten Pgp-3 und Pgp-9 Isotypen auf Nukleotidebene nur zu 39 % überein. Alle deduzierten Proteine zeigten die charakteristischen Merkmale der ABC-Transporterfamilie, wie z.B. je zwei Transmembran- und nukleotidbindenden Domänen. Ihre Molekülmasse lag bei ≈ 140 kDa. Zur funktionellen Charakterisierung und Identifizierung von Pgp-Substraten wurden erstmals die Nematoden-Pgps CegPgp-3 und CegPgp-9 in zwei Saccharomyces cerevisiae-Stämmen (AD1-7 und JRY8012) heterolog exprimiert. Beide Stämme zeichnen sich durch die Deletion von sieben bzw. drei hefeeigenen ABC-Transportern aus. Die Transkription der Transgene wurde für beide Pgps über eine RT-PCR bestätigt. Der Versuch über einen Western Blot mit Verwendung eines spezifischen anti-Pgp- (C219) und eines anti-V5-Antikörpers die Proteinexpression zu überprüfen, blieb erfolglos. Der Translationsnachweis erfolgte daher über ein fluorescence activated cell scanning (FACS). Der Anteil positiver Zellen war bei AD1-7 CegPgp-9 mit 20 % am höchsten, wobei hier anzumerken ist, daß der Antikörper nur aktives Pgp detektiert und die Versuche in Abwesenheit eines exogenen Pgp Substrats durchgeführt wurden. Bei CegPgp-3 erreichte er nur Werte von 2,3 bis 2,7 %. JRY8012 zeigte keine Expression von aktivem CegPgp-3. Für CegPgp-9 lagen die Werte nur bei 0,58 - 1,99 %. Im 96-Well-Format wurde im Rahmen eines neu etablierten, automatisierten, kompetitiven Wachstumsassays die Suszeptibilität der transformierten Hefen gegenüber dem BZ Thiabendazol und dem Pgp-Inhibitor und –Substrat Ketokonazol (KCON) untersucht. Dabei wurde über 48 h alle 10 min die OD600 der Hefekulturen bestimmt und die ermittelten Wachstumskurven statistisch ausgewertet. Über eine logistische Regression mit vier Parametern wurde das relative Wachstums der Hefestämme mit und ohne Pgp-Expression verglichen sowie EC50 Werte berechnet. Für keinen der transformierten JRY8012-Stämme zeigten sich signifikante Unterschiede zum Kontrollstamm mit LacZ-Expression, was wahrscheinlich mit einer zu geringen Pgp-Expression zusammenhängt. Die EC50 Werte von AD1-7 CegPgp-9 und LacZ wichen hingegen signifikant voneinander ab. Hefen, die CegPgp-rd4e 9 exprimierten, tolerierten ohne Wachstumseinbußen eine KCON -Konzentration von 0,73 μM im Gegensatz zu 0,18 μM im Kontrollstamm (LacZ). Des Weiteren wurden im gleichen Wachstumsassay verschiedene ML auf ihre potentielle Interaktion mit KCON am heterolog exprimierten Pgp untersucht. Die Ergebnisse zeigen einen moderaten, konzentrationsabhängigen und wachstumsmindernden Effekt von EPM und IVM auf AD1-7 CegPgp-9. Die Zugabe von MOX bewirkte keine Wachstumshemmung. In den verwendeten ML-Konzentrationen, die geringer waren als für die Pgp-exprimierenden Stämme, zeigte sich kein direkter Einfluss auf das Wachstum des Kontrollstammes. Die Kombination aus KCON (0,18 bzw. 0,73 μM) mit ML führte in allen Fällen zur signifikanten, konzentrationsabhängigen Steigerung der KCON-Wirkung. Die Ursache der potentiellen Synergie zwischen KCON und ML ließ sich mit der angewendeten Methode nicht feststellen. Möglich wären unter anderem eine kompetitive Verdrängung von KCON an einer Substratbindungsstelle am Pgp oder eine ML-induzierte Inhibition der Pgp-Aktivität. Das etablierte, automatisierte Wachstumsassay ermöglicht die einfache und kostengünstige funktionelle Untersuchung von Pgps auf Proteinebene. Die Identifizierung von Pgp-Substraten und Wirkstoffinteraktionen können von großem Nutzen sein für die nachhaltige Verwendung von Anthelminthika und die Entwicklung neuer Wirkstoffe, welche z.B. unbeeinflusst sind von der Pgp-Expression.