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Etablierung eines histologischen Protokolls zur intestinalen Mukusdarstellung sowie Untersuchungen zum Einfluss unterschiedlicher Zinkaufnahmen auf den Mukus im Darm von Absetzferkeln (2017)

Art

Hochschulschrift

Autor

Hüttner, Friedrich Joseph (WE 4)

Quelle

Berlin: Mensch und Buch Verlag, 2017 — X, 132 Seiten

ISBN: 978-3-86387-824-5

Verweise

URL (Volltext): https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/5071

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Abstract / Zusammenfassung

Die Förderung der Tiergesundheit ist aus ökonomischen sowie ethischen Aspekten ein zentrales Anliegen wissenschaftlicher Untersuchungen. In der Schweineaufzucht ist das Absetzen der Ferkel von der Sau eine besonders kritische Phase, insbesondere hinsichtlich der Darmgesundheit. Eine bedarfsüberschreitende Fütterung des Spurenelements Zink erwies sich in wissenschaftlichen Untersuchungen als wirksam gegen Durchfall nach dem Absetzen und zeigte positive Auswirkungen auf die Futteraufnahme und die Gewichtszunahme sowie Einfluss auf die Mukuszusammensetzung im Darm. Der Mukus wird von Becherzellen produziert und stellt eine wichtige physikalische und immunologische Barriere vor dem Schleimhautepithel dar. Da bisher keine Untersuchungen zu Auswirkungen von Zink auf die intestinale Mukusschichtdicke vorliegen, war das Ziel dieser Arbeit, den Effekt unterschiedlicher alimentärer Zinkdosen auf die Mukusschichtdicke und die Kryptentiefe der Schleimhaut im Kolon sowie der Expression verschiedener Peptide des Mukus im Jejunum und im Kolon von Absetzferkeln zu untersuchen. Die histologische Darstellung und Quantifizierung des Mukus ist aus methodischer Sicht äußerst schwierig. Zudem existiert eine Vielzahl von Nachweismethoden, deren Spektrum von den üblichen histologischen Fixierungsprotokollen bis zu aufwendigen in vivo-Untersuchungen reicht, sodass eine Vergleichbarkeit der jeweiligen Ergebnisse nicht uneingeschränkt möglich ist. Vor diesem Hintergrund war die Etablierung eines optimierten Fixierungs- und Färbeprotokolls zur intestinalen Mukusschichtdarstellung ein Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit.

Bei den Versuchstieren handelte es sich um 24 gesunde, früh abgesetzte Ferkel im Alter vom 25. bis 38. Lebenstag, davon 12 Tiere weiblich und 12 Börge. Die Säugeperiode betrug im Mittel 25 Tage. Während der Säugeperiode wurde den Ferkeln kein Ergänzungsfuttermittel angeboten. Die Aufzucht erfolgte in klimatisierten Ferkelaufzuchtställen (Vollspalten-Flatdeck) mit zwei Ferkeln je Einzelbucht. Es wurden jeweils acht Ferkel (vier Börge, vier weibliche Tiere) gleichmäßig auf drei Versuchsgruppen mit und ohne Zulage von Zinkoxid in unterschiedlichen Dosierungen aufgeteilt (A = 0 mg ZnO/kg Futter, B = 100 mg ZnO/kg Futter, C = 1000 mg ZnO/kg Futter). Die Aufzuchtperiode betrug zwei Wochen. Hierbei wurden ein Alleinfuttermittel sowie Wasser ad libitum angeboten. Unmittelbar nach der Tötung der Tiere wurden Proben des mittleren Jejunums und aszendierenden Kolons entnommen und umgehend physikalisch mittels flüssigem Stickstoff oder chemisch mittels Methacarn, probeweise auch mittels Carnoy und Bouin fixiert.

Stickstofffixierte Schnitte wurden anschließend mit einer Hitzeplatte dehydriert. Neben der probeweisen Durchführung von Direktfärbungen wurden die histologischen Gefrierschnitte in der Regel vor der Färbung mittels Paraformaldehyddampf (PFA), vierprozentiger neutral gepufferter Formalinlösung (4%NBF), Ethanol und weiteren Fixationen postfixiert. Bei der anschließenden Färbung wurden Alcianblau, PAS, Alcianblau-PAS, Hämatoxylin-Eosin, Astrablau und verschiedene Lektine verglichen.

Die Ermittlung der Mukusschichtdicke erfolgte einerseits über eine „Zehnpunktemessung“ senkrecht zum Epithel bis zum Darminhalt. Zum anderen wurde die Mukusfläche durch Bildung eines Polygons als Ganzes berechnet und die berechnete Fläche durch die Länge der darunter liegenden Schleimhaut dividiert („Integralmessung“).

Anschließend wurde die Auswirkung unterschiedlicher Zinkdosen im Futter von Absetzferkel auf die Schichtdicke des Mukus sowie die Kryptentiefe im Kolon untersucht. Darüber hinaus wurden die Expressionshöhen der mRNA von MUC2, Trefoil factor 3 sowie beta-Defensin 3 mittels qRT-PCR im mittleren Jejunum und im aszendierenden Kolon analysiert.

Die Ergebnisse zeigten, dass die Gefrierfixierung durch Stickstoff zu einem zuverlässigen Mukuserhalt führte. Bei Verwendung von Methacarn waren in der Regel Ablösungen des Darminhalts sowie der Mukusschicht von der Darmwand zu beobachten. Der Vergleich der Mukusschichtdicke nach Gefrier- oder chemischer Fixierung ergab keinen Unterschied. Der entscheidende Vorteil der Gefrierfixierung lag in der überwiegend intakten Schichtung von Darmwand – Mukus – Darminhalt.

Die Postfixation der Gefrierschnitte erwies sich als notwendig für den Mukuserhalt. Der Vergleich von Ethanol, 4%NBF und PFA als Postfixationen ergab keinen Unterschied in den gemessenen Mukusschichtdicken. Dagegen hatte die Auswahl der anschließenden Postfixation einen Einfluss auf die Mukusdarstellung. PFA zeigte gegenüber Ethanol und 4%NBF eine laminare Schichtung des Mukus im Kolon, der dem bisherigen Verständnis des Schleims entspricht. In der anschließenden AB-PAS-Färbung wurde keine Abhängigkeit der Mukusdicke von unterschiedlichen pH-Werten der Alcianblaulösung nachgewiesen. Alcianblau pH 2,5-PAS wurde jedoch aufgrund der vollständigen Löslichkeit des Färbemittels gegenüber Alcianblau pH 0,5-PAS bevorzugt. Auch die Auswertung der Mukusschichtdicke mittels Zehnpunkte- bzw. Integralmessung ergab keinen Einfluss auf die Messergebnisse der Mukusschicht. Durch die Bildung eines Polygons ist die Integralmessung wahrscheinlich mathematisch präziser und verringert die Gefahr von Ergebnisverzerrungen.

Die Parameter für die favorisierte Methode lassen sich wie folgt definieren:

- Verwendung von Absetzferkeln bei ad libitum-Fütterung.

- Vorsichtige Probenentnahme unmittelbar post mortem.

- Verwendung der Gefrierfixierung des intakten Darmrohres durch Stickstoff, ohne Spülung des Darms oder andere Gewebepräparationen.

- Schneiden der Proben im Kryostaten und Aufziehen der Schnitte auf vorgewärmte (50 °C), silanisierte Objektträger.

- Trocknung der Schnitte auf einer Hitzeplatte (mindestens 30 min bei 50 °C) und anschließende Postfixation mittels Paraformaldehyddampf für 6 h bei 60 °C im Brutschrank.

- Färbung der histologischen Schnitte mittels Alcianblau pH 2,5-PAS und Eindecken mittels Roti-Histokitt.

- Messung und Auswertung der Mukusschichtdicke mittels „Integralmessung“.

Im Jejunum konnte Mukus auf diese Weise histologisch dargestellt werden. Allerdings war in diesem Darmabschnitt aufgrund mangelnder Begrenzung durch Chymus keine morphometrische Schichtdickenmessung möglich. Für weitere Studien am Dünndarm ist die Auswahl eines anderen Darmsegments oder eine gezielte letztmalige Fütterung zur Herstellung eines gefüllten Jejunums denkbar.

Hinsichtlich der Fütterung unterschiedlicher Zinkdosen wurde im Kolon kein Einfluss auf die Mukusdicke, die Kryptentiefe oder die MUC2-Expression nachgewiesen. Bei Betrachtung der Kryptentiefe als einen Parameter für die Anzahl der Becherzellen bzw. die MUC2-Expression als einen Parameter für die Aktivität der Becherzellen, erscheint plausibel, dass die Mukusschichtdicke von unterschiedlichen Zinkgehalten unbeeinflusst blieb. Die MUC2-Expression im Jejunum sowie die Expression von Trefoil factor 3 im Jejunum und im Kolon wiesen ebenfalls keinen Einfluss unterschiedlicher Zinkgehalte im Futter auf. Lediglich die Expression von beta-Defensin 3 im Jejunum zeigte sich bei hoher Zinkfütterung tendenziell erhöht. Auffällig ist die hohe Streuung der Messungen innerhalb der Gruppen. Dieses Ergebnis ist somit eher als zufälliger Effekt der Messdatenverteilung zu interpretieren.

In der vorliegenden Arbeit war der Mukuserhalt abhängig von der Auswahl des Fixierungsprotokolls. Die Verwendung der Gefrierfixierung mit anschließender Dehydration auf einer Hitzeplatte sowie Verwendung von Paraformaldehyddampf als Postfixation führte im Kolon zu einem zuverlässigen Mukuserhalt und ergab reproduzierbare Ergebnisse. Chemische Fixierungen wie Methacarn oder Carnoy waren für den Mukuserhalt nicht geeignet.

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit könnten zur Etablierung eines „Goldstandards“ für die histologische Mukusdarstellung im Kolon von Schweinen beitragen.

Die Auswertung der Fütterung unterschiedlicher Zinkdosen zeigte keinen Einfluss auf die Mukusschichtdicke im Kolon von Absetzferkeln.