Fachbereich Veterinärmedizin


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    Interferenz des Hepatitis-B-Virus mit insulinabhängig regulierten Signalwegen:
    Interference of Hepatitis B Virus with insulin-dependent signaling pathways (2017)

    Art
    Hochschulschrift
    Autor
    Bogenhagen, Thekla (WE 3)
    Quelle
    Berlin, 2017 — iv, 116 Seiten
    Sprache
    Englisch
    Verweise
    URL (Volltext): http://www.diss.fu-berlin.de/diss/receive/FUDISS_thesis_000000104252
    Kontakt
    Institut für Veterinär-Biochemie

    Oertzenweg 19 b
    14163 Berlin
    Tel.+49 30 838 62225 Fax.+49 30 838-62584
    email:biochemie@vetmed.fu-berlin.de

    Abstract / Zusammenfassung

    Das humane Hepatitis-B-Virus (HBV) ist ein 42 nm großes partiell doppelsträngiges DNA-Virus, das der Familie der Hepadnaviridae zugeordnet wird [Modrow et al., 2010]. Infektionen mit HBV können akute und chronische Leberentzündungen hervorrufen und gelten als einer Hauptrisikofaktiren für hepatozelluläre Karzinome (HCC), welche die häufigste Form der malignen Lebertumoren darstellen [Schaedler et al., 2010]. Eine verminderte Leberregeneration begünstigt hierbei die Entstehung einer Leberfibrose beziehungsweise -zirrhose und führt zu einem Verlust von funktionellem Leberparenchym [Lok and McMahon, 2007]. Ein wichtiger regulatorischer Faktor für die Leberregeneration ist der Transkriptionsfaktor nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2). Dieser bindet an die antioxidant response elements (ARE)-Region verschiedener Gene und kontrolliert so die Expression von Proteinen, die für Detoxifikation und Elimination von Elektrophilen und ROS zuständig sind und liegt vermehrt in HBV-positiven Zellen vor [Nguyen et al., 2009, Schaedler et al., 2010]. Darüber hinaus konnte in Nrf2-knock-out-Mäusen nach partieller Hepatektomie eine verminderte Leberregeneration beobachtet werden. Dies ist durch einen erhöhten ROS-Spiegel bedingt, der zu einer Hemmung der insulinab- hängigen Signaltransduktion führt [Beyer et al., 2008]. Im Rahmen dieser Arbeit sollte der Einfluss des HBV auf die Insulin-/IGF-1-Signalkaskade und der Einfluss von Nrf2 auf die Leberregeneration in HBV-positiven Zellen untersucht werden.

    Zunächst wurde die Mengen wichtiger Proteine der Insulin-Signalkaskade im Western Blot analysiert. Diese zeigten, dass in HBV-replizierenden Zellen eine signifikant höhere Menge an Insulin-Rezeptor enthalten ist, wohingegen weder die Menge des Insulin-like-growth-factor-Rezeptor (IGF-Rezeptors) noch des Insulinrezeptor-Substrats-1 (IRS-1) verändert ist (siehe Kapitel 5.1, Abbildung 5.1, Abbildung 5.5 und Abbildung 5.6). Die höhere Expression des Insulin-Rezeptors wurde anschließend in transient transfizierten HBV-replizierenden Zelllinien durch Immunfluoreszenzuntersuchungen bestätigt. Der Rezeptor scheint jedoch internalisiert und nicht plasmamembranassoziiert vorzuliegen (siehe Kapitel 5.1, Abbildung 5.2). Da auch die IR-mRNA-Mengen in HBV-replizierenden Zellen erhöht sind, kann von einer heraufgesetzten Expression und nicht von einer verminderten Rezeptordegradation ausgegangen werden (siehe Kapitel 5.1, Abbildung 5.3). Eine der möglichen Erklärungen hierfür wäre eine Insulin-Rezeptor-Retention durch α-Taxilin, welches den intrazellulären Vesikeltransport inhibiert und in HBV-replizierenden Zellen in erhöhter Menge vorliegt [Hoffmann et al., 2013]. Aufgrund der erhöhten IR-Menge in HBV-replizierenden Zellen in vitro wurden diese Ergebnisse auch in in vivo verifiziert, sowohl durch Verwendung von HBV-transgenen Mäusen als auch durch Leberschnitte von HBV-infizierten Patienten (siehe Kapitel 5.1, Abbildung 5.4 und Kapitel 5.3.1, Abbildung 5.17).

    Um mehr Informationen über die Aktivierung des Insulin-/IGF-1-Signalweges zu bekommen, wur- den anschließend stabil HBV-replizierende Hepatoblastomzellen und Kontrollzellen mit Insulin und Glukoseoxidase stimuliert, um kontinuierlichen ROS durch Wasserstoffperoxid zu erzeugen (siehe Kapitel 6, Abbildung 6.1). Die Daten bestätigen, dass der Insulin-/IGF-1-Signalweg auf der Rezep- torebene sowohl in HBV-positiven als auch in HBV-negativen Zellen normal aktiviert wird. Die Aktivierung in HBV-replizierenden Zellen ist sogar höher als die in negativen Zellen, wenn gleichzeitig mit Insulin und Glukoseoxidase stimuliert wird (siehe Kapitel 5.2.1, Abbildung 5.10). Da HBV eine Aktivierung der Nrf2-/ARE-abhängig regulierter Gene bewirkt, könnte dies ein Mechanismus sein, um das Überleben der infizierten Zellen zu sichern, die Immunantwort zu modifizieren und somit die Infektion zu manifestieren [Schaedler et al., 2010].

    Eine Studie mit Nrf2-knockout-Mäusen konnte zeigen, dass die Phosphorylierung von IRS-1 an Tyrosin als Folge einer Insulinstimulation deutlich vermindert war nach partieller Hepatektomie. Dies scheint der Grund für eine Insulinresistenz in Nrf2-knockout-Hepatozyten zu sein, da die IR-Phoyphorylierung normal war [Beyer and Werner, 2008, Beyer et al., 2008]. Die Phosphorylierung von IRS-1 an Serin in HepAD38 und HepG2.2.15, welche mit Glukoseoxidase stimuliert wurden, ist deutlich vermindert verglichen mit HBV-negativen Zellen (siehe Kapitel 5.2.2, Abbildung 5.12). Dies zeigt einmal mehr, dass HBV-positive Zellen verglichen mit HBV-negativen Zellen weniger durch ROS beeinträchtigt werden. Die Aktivität von JNK als ein Mediator der Insulinresistenz durch Phosphorylierung von IRS-1 an Serin ist reduziert in HBV-replizierenden Zellen, obwohl mehr p-IRS-Ser vorliegt (siehe Kapitel 5.2.2, Abbildung 5.12 und Kapitel 5.2.3, Abbildung 5.14) [Beyer et al., 2008]. Dies bestärkt die Vermutung, dass mindestens eine weitere Kinase neben JNK die Phosphorylierung an IRS reguliert. Zusammenfassend konnte in HBV-replizierenden Zellen gezeigt werden, dass erhöhte ROS-Level nicht die Aktivierung des Insulin-/IGF-1-Signalweges beeinträchtigen. Jedoch könnte ROS durch das Immunsystem vor allem durch zytotoxische T-Zellen deutlich ausgeprägter in vivo sein. Uner- warteterweise weisen HBV-positive Zellen deutlich höhere Mengen des Insulin-Rezeptors auf, die jedoch internalisiert vorliegen. In zukünftigen Exerimenten sollte untersucht werden, ob der Rezeptor wirklich normal zur Zellmembran transportiert wird oder dieser internalisiert akkumuliert und eventuell doch zu reduzierter Insulinbindung führt.

    In Nrf2-knockout Mäusen kommt es nach partieller Hepatektomie zu einer verzögerten Leberregenera- tion [Beyer et al., 2008]. Deshalb war es überaus interessant zu untersuchen, ob die Leberregeneration in HBV-transgenen Mäusen ebenfalls reduziert ist im Vergleich zu C57BL/6-Kontrolltieren. Es konnte gezeigt werden, dass weibliche HBV-transgene Mäuse eine reduzierte und männliche HBV-transgene Mäuse eine verzögerte Leberregeneration verglichen zu C57BL/6-Kontrolltieren aufweisen (siehe Kapitel 5.3.4, Abbildung 5.23). Zusätzlich wurden die beiden Transaminasen ALT und AST im Serum nach Hepatektomie bestimmt, um den aufgetretenen Leberschaden zu ermitteln (siehe Kapitel 5.3.5, Abbildung 5.24 und 5.25). Die zunächst erhöhten AST- und ALT-Werte nach Hepatektomie lassen sich vor allem auf die chirurgische Intervention zurückführen und nicht auf eine erhöhte Apoptose. Um dies zu bestätigen, wurden zusätzlich ein TUNEL-Assay und ein cleaved-PARP-ELISA durchgeführt. Zusammenfassend zeigen diese in vivo-Daten, dass eine beieinträchtigte Regeneration vorliegt, hierbei scheint sich jedoch um einen von Nrf2 unabhängigen Prozess zu handeln, da HBV die Expression der Nrf2-/ARE-regulierten Proteine induziert [Schaedler et al., 2010]. In weiteren Experimenten sollte der Probenumfang erhöht werden und es wäre interessant zu wissen, ob die BrdU-positiven Zellen HBV-positive oder negative Zellen sind. So könnte festgestellt werden, ob beide Zellen gleichermaßen auf den Regenerationsreiz der Hepatektomie reagieren. Darüber hinaus wäre es interessant zu wissen, ob eine unterschiedliche Regeneration nach CCl4-induzierter Leberschädigung erfolgt.