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Hepatozyten und hepatische Progenitorzellen:
Isolierung und Charakterisierung aus humanem, explantiertem Lebergewebe mit dem Ziel der Zelltransplantation (2016)

Art

Hochschulschrift

Autor

Belaschk, Sascha Elisa (WE 12)

Quelle

Berlin, 2016 — X, 141 Seiten

Verweise

URL (Volltext): https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/1527

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Institut für Tierpathologie

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Abstract / Zusammenfassung

Das Forschungsprojekt des Neohybriden Lebertransplantates verfolgt das Ziel, die beiden Therapieformen der Lebertransplantation und Leberzelltransplantation miteinander zu verbinden. Durch ein in vivo Tissue- Engineering soll eine operationale Toleranz, das heißt das Ausbleiben einer schädigenden, immunologischen Reaktion gegenüber der Spenderleber, induziert werden. Die Grundidee beruht auf einer nach der Organtransplantation durchgeführten Zelltransplantation mit autologen Hepatozyten, welche anschließend die Spenderleber besiedeln. Auf diese Weise soll der Bedarf an immunsuppressiven Medikamenten nach der Lebertransplantation gesenkt werden. Hierfür sollten funktionale Hepatozyten und Leberzellvorläufer aus dem explantierten, hochgradig pathologisch verändertem Lebergewebe der Organspendeempfänger gewonnen und auf ihre Eignung für die Zelltransplantation geprüft werden. In der vorliegenden Arbeit wurden die Ergebnisse der Zellisolierung aus 23 erkrankten, explantierten Lebern und 14 Leberteilresektaten aus unverändertem Lebergewebe von menschlichen Patienten miteinander verglichen. Die Hepatozyten wurden in Kultur auf ihre Viabilität und metabolische Aktivität getestet und zudem einer Kühllagerung über bis zu 48 Stunden unterzogen. Die Nichtparenchymale Zellfraktion wurde mittels Durchflusszytometrie charakterisiert und zwei Anreicherungsmethoden für Leberzellvorläufer getestet. Zudem wurde ein neuartiges Mausmodell entwickelt, mit dem nachfolgend die Eignung der Hepatozyten aus explantiertem Lebergewebe für die Zelltransplantation geprüft werden soll. Trotz des jeweils klinisch manifesten Leberversagens, welches die Durchführung einer Lebertransplantation notwendig machte, konnten aus den explantierten Lebern funktionale Hepatozyten isoliert und kultiviert werden. Die Isolierungsergebnisse unterschieden sich dabei nicht signifikant von denen aus unverändertem Lebergewebe. Auch bezüglich ihrer Viabilität und metabolischen Aktivität in der Zellkultur waren die Unterschiede zwischen den Hepatozyten aus erkrankter, explantierter Leber und dem unveränderten Gewebe der Leberteilresektate gering. Tatsächlich gab es sogar Anhaltspunkte, dass die Zellen aus erkranktem Lebergewebe in der Langzeitkultur stabiler sind. Die Kühllagerung der isolierten Hepatozyten über 24 und 48 Stunden konnte mit akzeptablen Verlusten der Zellviabilität durchgeführt werden. Die beiden getesteten Lagerungsmedien ChillProtec® und ChillProtec® plus unterschieden sich dabei nur geringfügig. Auch hier gab es Hinweise auf eine bessere Stabilität der Hepatozyten aus erkranktem, explantiertem Lebergewebe. Die Nichtparenchymale Zellfraktion wurde zunächst auf das Vorhandensein des Glykoproteins EpCAM, einem bekannten Oberflächenmarker für hepatische Progenitorzellen, und auf den Leukozytenmarker CD45 überprüft. Die Nichtparenchymale Zellfraktion erkrankter, explantierter Lebern enthielt dabei tendentiell mehr EpCAM- positive Zellen als die der Leberteilresektate. Dieser Unterschied war jedoch nicht statistisch signifikant. Im Rahmen weiterer Färbungen erwiesen sich die EpCAM-positiven Zellen zugleich als CD133/1-positiv, was die Annahme unterstützt, dass es sich dabei um potentielle Leberzellvorläufer handelte. Die EpCAM- und CD45-negative Zellfraktion, welche etwa die Hälfte der Nichtparenchymalen Zellfraktion ausmachte, enthielt bei erkrankten, explantieren Lebern signifikant mehr CD90-positive Zellen als bei Leberteilresektaten. Auch CD90 gilt als Marker für hepatische Progenitorzellen, so dass es sich bei diesen Zellen ebenfalls um potentielle Vorläufer für Hepato- und Cholangiozyten handelte. Die anschließend getesteten Anreicherungsverfahren mittels OptiPrep™-Dichtegradientenzentrifugation und Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS®) zur Gewinnung von Leberzellvorläufern für die Zelltransplantation erwiesen sich als ungeeignet. Mit dem neuartigen, für das Projekt optimierten Mausmodell ließen sich erfolgreich humane Hepatozyten aus Leberteilresektaten in der Mausleber ansiedeln. Es stellte sich heraus, dass die Viabilität der zu transplantierenden Zellen offensichtlich eine wichtige Rolle für den Repopularisierungserfolg spielt. Zudem wurden Fehlerquellen bei der Durchführung und Auswertung des Modells identifiziert, um dessen geplante Anwendung für Zellen aus explantierter Leber zu optimieren. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen die These, dass Hepatozyten aus erkranktem, explantiertem Lebergewebe für die Verwendung bei der Hepatozytentransplantation geeignet sein könnten. Es gab deutliche Hinweise dafür, dass aus hochgradig erkrankter Leber eine ausreichende Anzahl an Leberzellvorläufern für die Zelltransplantation isoliert werden kann. Beide Zelltypen müssen nun auf ihre repopulativen Eigenschaften hin untersucht werden, wofür sich das hier etablierte Mausmodell als geeignet erwies. Mit Hilfe des Projektes „Neohybrides Lebertransplantat“ soll lebertransplantierten Menschen eine längere Überlebenszeit bei höherer Lebensqualität gewährleistet werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die Aussichten auf eine Realisierung dieses Projektes.