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Einfluss bestimmter bone morphogenetic proteins auf die endotheliale Permeabilität (2015)

Art

Hochschulschrift

Autor

Hornstein, Alexandra Marielisa (WE 1)

Quelle

Berlin: Mensch und Buch Verlag, 2015 — 77 Seiten

ISBN: 978-3-86387-689-0

Verweise

URL (Volltext): https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/8930

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Institut für Veterinär-Anatomie

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Abstract / Zusammenfassung

Erhöhte endotheliale Permeabilität ist die Ursache vieler vaskulärer Erkrankungen und führt zu Gewebsödemen und Entzündungen. Ursächlich für eine endotheliale Dysfunktion kann der Verlust der transmembranen Proteine Occludin und VE-Cadherin sein. Infolge einer Abnahme der endothelialen Zell- Zellkontakte kommt es zu einer Kontraktion und Umstrukturierung des Zytoskelettes, wodurch vermehrt immunrelevante Zellen durch den erweiterten endothelialen Spalt dringen können. Bone morphogenetic proteins (BMPs) spielen bei der endothelialen Inflammation eine wichtige Rolle. Die Wirkungsmechanismen der BMPs auf die endotheliale Permeabilität sind bis heute jedoch unbekannt. Ziel dieser Arbeit ist es herauszufinden, ob und über welche Mechanismen, bestimmte BMPs und deren Modulatoren die endotheliale Permeabilität beeinflussen. Um Permeabilität messbar zu machen, wurden im Rahmen dieser Arbeit in vitro und in vivo Methoden etabliert. Zellkulturergebnisse wurden über einen Transwell gewonnen, in dessen oberes Kompartiment die zu testende Epithelschicht oder Endothelschicht auf einen Filter aufgetragen wurde. Als Permeabilitätsindikator fungierte ein fluoreszierender Farbstoff (FITC-Dextran) oder isolierte Immunzellen (PBMCs). Gemessen wurde die Menge des diffundierten Farbstoffes oder der transmigrierten PBMCs durch die Zellschicht, nach Stimulation der Zellen mit den BMPs oder ihren Modulatoren. In vivo wurden zur Permeabilitätsmessung Mäuse mit Bleomycin oder BMP4 behandelt. Als Permeabilitätsindikator fungierte hier der Farbstoff Evans Blue (EVB), der in die Schwanzvene injiziert wurde. Photometrisch quantifiziert wurde die Menge des Farbstoffes der in Herz, Lunge, Niere, bronchoalveoläre Lavage (BAL) und Aszitesflüssigkeit diffundieren konnte. Nach Zellschädigung, verursacht durch Stimulation mit Bleomycin, wurde analysiert, ob die epitheliale und endotheliale Permeabilität zunimmt. In vitro im Transwell führt die Schädigung der Bronchialepithelzellen zu einer erhöhten FITC-Dextran Permeabilität. In vivo zeigten die Mäuse eine signifikant höhere EVB Diffusion in Lunge, Niere und BAL. Nach Stimulation mit BMP2, 4, 7 und 9 konnte im Transwell ein signifikanter Permeabilitätsanstieg durch die Endothelzellschicht gemessen werden. In vivo zeigen Mäuse nach Stimulation mit rekombinanten murinen BMP4 i.p. eine signifikant höhere Evans Blue Diffusion in die Aszitesflüssigkeit und Herz, Lunge und Niere. Vor hohem klinischem Interesse ist die Frage, ob sich BMPs auf die Transmigration von Entzündungszellen auswirken. In vitro wurde eine Inflammation durch TNF-a induziert und in vivo durch Thioglycolate. Nach BMP4 Stimulation nimmt die Anzahl der transmigrierten PBMCs in vitro durch die Endothelzellschicht zu. In vivo konnten nach BMP4 Stimulation mehr Leukozyten im Blut und in der Aszitesflüssigkeit gezählt werden. Um festzustellen wie sich BMPs und deren Modulatoren auf die transmembranen Proteine auswirken, wurde die Expression von VE-Cadherin, Occludin und PECAM1 mit Hilfe eines Western Blots quantifiziert. Hierfür wurden Endothelzellen über drei Tage mit BMP2 4, 7 und 9 stimuliert. Anschließend wurde die Protein Expression mit Antikörpern für VE-Cadherin, Occludin und PECAM1 im Western Blot sichtbar gemacht und quantifiziert. BMP2 und 4 führen zu einer signifikanten Reduktion von Occludin, BMP2, 4 und 7 reduzieren signifikant die Expression von VE-Cadherin. Diese Reduktion konnte für BMP4 mit Hilfe einer VE-Cadherin Färbung visuell dargestellt werden. Nach knock down von BMP4 kam es zu einem Anstieg von VE- Cadherin. BMP9 reduzierte als einziges getestetes BMP die Expression von PECAM1 signifikant. Auch in einer BMP9 Konzentrationsreihe und einer speziellen PECAM1-Färbung konnte die Reduktion von PECAM1 nach Stimulation mit BMP9 bestätigt werden. Zusätzlich wurde mit Hilfe einer Phalloidinfärbung gezeigt, dass die Stimulation mit BMP2, 4, 7 und 9 die Zellmorphologie des Endothels verändert und zu einer vermehrten Ausbildung von Stressfasern führt. Um eine Substanz zu finden, die sich schützend auf die endotheliale Permeabilität auswirkt, wurde die Wirkung der BMP-Modulatoren Gremlin, Noggin, TSG, BMPER, LDN und Chordin auf die endotheliale Permeabilität getestet. Gremlin stärkt die endotheliale Barrierefunktion und führt zu einer gesteigerten Expression von Occludin. Im Rahmen dieser Arbeit konnten erstmalig zwei Mitglieder der BMP Familie, BMP4 und Gremlin, mit gegensätzlicher Wirkung auf die endotheliale Permeabilität identifiziert werden. BMP4 führt zu einer erhöhten endothelialen Durchlässigkeit durch die Reduktion von Occludin und VE-Cadherin. Der BMP Antagonist Gremlin führt hingegen zu einer gesteigerten Barrierefunktion des Endothels durch die erhöhte Expression von Occludin. Die gezielte Hemmung der BMP Aktivität könnte zu neuen therapeutischen Ansatzpunkten in der Behandlung von Ödemen und Entzündungen führen.