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In situ Identifizierung und Charakterisierung endothelialer Progenitorzellen im bovinen Ovar (2015)

Art

Hochschulschrift

Autor

Schoen, Kornelia (WE 1)

Quelle

Berlin: Mensch und Buch Verlag, 2015 — 94 Seiten

Verweise

URL (Volltext): https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/7853

Kontakt

Institut für Veterinär-Anatomie

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Abstract / Zusammenfassung

Das Ovar unterliegt im Laufe des Zyklus starken Veränderungen, die sich unter anderem in einem intensiven Blutgefäßwachstum während der Anbildung des Corpus luteum und einer Rückbildung von Blutgefäßen während der Luteolyse äußern. Die Neovaskularisationsprozesse umfassen ein Drittel der gesamten Zykluslänge und sind intensiver als in malignen Tumoren. Der Ursprung der stark proliferierenden Endothelzellen im Corpus luteum ist bis heute nicht gänzlich geklärt. Die Hypothese der vorliegenden Arbeit besagt, dass endotheliale Progenitorzellen (endothelial progenitor cells, EPCs) als lokale Ressource dienen und somit maßgeblich an Neovaskularisationsprozessen im Ovar beteiligt sind. Das Ziel dieser Arbeit war daher der qualitative und quantitative Nachweis von endothelialen Progenitorzellen im Ovar des Rindes. An Paraffinschnitten des Rinderovars konnten mittels Anti-KDR und Anti-CD34 immunhistochemisch doppelt markierte Zellen nachgewiesen werden. KDR und CD34 repräsentieren die am häufigsten genutzte Marker-Kombination, um endotheliale Progenitorzellen zu identifizieren. Die markierten Zellen waren in der Tunica media und selten in der Tunica adventitia von Arterien, sowie lediglich sporadisch in venösen Gefäßen, nachweisbar. Vorrangig befanden sich die markierten Blutgefäße innerhalb des Corpus luteum und in der direkten Umgebung der Funktionskörper des Ovars. Diese Ergebnisse deuten auf die Blutgefäßwand als mögliche Quelle von endothelialen Progenitorzellen im Ovar des Rindes hin. Um die immunhistochemischen Ergebnisse zu untermauern, erfolgte zusätzlich mittels RT-qPCR ein Nachweis der Progenitorzellmarker KDR und CD34 als auch des Stammzellmarkers CD133 (Prominin-1). Aus dem Ovar des Rindes waren hierfür während verschiedener lutealer Stadien Proben aus unterschiedlichen Lokalisationen entnommen und untersucht worden. Mittels der RT-qPCR Ergebnisse konnte eine Korrelation der Marker CD34 und KDR nachgewiesen werden, wodurch der mögliche endotheliale-Progenitorzell-Charakter der immunhistochemisch mit Anti-KDR und Anti-CD34 markierten Zellen unterstützt wurde. CD133 zeigte sein Expressionsmaximum im lutealen Stadium der Anbildung. Während dem lutealen Stadium der Rückbildung und der Trächtigkeit war die Expression dieses Markers signifikant reduziert. Die hohe Korrelation der Expression von CD34 und CD133 bestätigte zusätzlich die Hypothese, dass Stamm-/Progenitorzellen im Ovargewebe vorkommen. Das Vorhandensein ortsständiger endothelialer Progenitorzellen innerhalb des Ovars scheint daher sehr wahrscheinlich. Grundlage für die Erzielung verlässlicher molekularbiologischer Ergebnisse mittels RTqPCR, ist eine Normalisierung der Zielgenexpression mit Hilfe von stabil exprimierten Referenzgenen (RG). Auf diese Weise ist es möglich, experimentell induzierte Variationen von tatsächlichen biologischen Variationen zu unterscheiden. Das bovine Ovar enthält eine Vielzahl heterogener Zellpopulationen innerhalb der unterschiedlichen Lokalisationen. Diese unterliegen sowohl auf morphologischer wie auch auf molekularbiologischer Ebene einer Beeinflussung durch den Sexualzyklus und die Trächtigkeit. Zum Zeitpunkt der Untersuchung standen keine validierten Referenzgene zur Verfügung, welche sowohl die morphologische als auch die zyklische Heterogenität des Organs berücksichtigen. Daher wurden insgesamt zwölf potentielle Referenzgene auf ihre Eignung mittels unterschiedlicher Berechnungsalgorithmen (GENORM, NORMFINDER, BESTKEEPER) untersucht. Die Referenzgene H3F3B, RPS9, YWHAZ, RPS18, POLR2C und UBA52 waren in dieser Untersuchung die am stabilsten exprimierten Gene. Damit stellten diese Gene einen Pool an Referenzgene zur Normalisierung von RT-qPCR Ergebnissen für das bovine Ovar dar. Aus diesem Pool können für bovine Ovarien des gesunden Rindes YWHAZ, H3F3B und RPS9 zur Normalisierung von RT-qPCR Ergebnissen unabhängig von der Probenlokalisation oder dem lutealen Stadium empfohlen werden. Trotzdem ist eine Revalidierung der Referenzgene für jedes neue Experiment empfehlenswert. Die Software Programme GENORM, NORMFINDER und BESTKEEPER haben unterschiedliche Vorteile und auch Schwachpunkte bei der Ermittlung stabil exprimierter Referenzgene. Deshalb ist es empfehlenswert, mindestens zwei unterschiedliche Berechnungsalgorithmen anzuwenden, wobei eine Berücksichtigung von Variationen zwischen unterschiedlichen Probengruppen nur mittels des NORMFINDER Algorithmus möglich ist.