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Etablierung der In-utero-Elektroporation des zentralen Nervensystems im Mausmodell C57BL/6 (2015)

Art

Hochschulschrift

Autor

Baumgart, Jan (WE 1)

Quelle

Berlin: Mensch und Buch Verlag, 2015 — VIII, 158 Seiten

ISBN: 978-3-86387-681-4

Verweise

URL (Volltext): https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/11016

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Abstract / Zusammenfassung

Die vorliegende Dissertation beschreibt neue Aspekte in der Entwicklung der Methode der In-utero-Elektroporation (IUE) und nimmt dabei Bezug auf die Neurogenese und die kortikale Migration im zentralen Nervensystem. Mithilfe der beschriebenen Transfektionstechnik konnte durch Regulation der Expression definierter Proteine die Entwicklung neuronaler Stammzellen im Iso- und Allokortex manipuliert werden. Im ersten Abschnitt dieser Arbeit wurden die Funktionalität und die Aussagekraft dieser Manipulationen in der C57BL/6-Wildtypmaus in unterschiedlichen Embryonalstadien zwischen E12 bis E17 untersucht. Weiter wurden die Standardwerte der Elektroporation und Transfektion definiert. Dabei wurden unterschiedliche Plasmide in vitro und in vivo getestet und nötige Spannungswerte und Injektionsstellen für eine erfolgreiche Transfektion untersucht. Der Erfolg konnte durch fluoreszierende Signale und die Anzahl transfizierter Zellen gemessen werden. Für die Durchführung der In-utero-Elektroporation wurden die operativen Parameter mit der geringsten Letalität, aber einer hohen Effektivität der Transfektion von Embryonen bestimmt. Zur weiterführenden Analyse mithilfe der In-utero- Elektroporation wurden mögliche Transfektionsregionen in dem C57BL/6-Mausmodell erschlossen und ein Atlas mit den Elektrodenwinkeln zur Transfektion unterschiedlicher Großhirnbereiche erstellt. Transfektionen mit 2 unterschiedlichen Plasmiden im selben Embryo konnten ebenfalls erfolgreich durchgeführt werden. Es zeigte sich dabei, dass die In-utero-Elektroporation in unterschiedlichen Hemisphären ideal für den Vergleich der Auswirkungen der transfizierten Plasmide genutzt werden kann. Hingegen stellt die Transfektion zweier unterschiedlicher Plasmide in derselben Hemisphäre eine optimale Analysemethode für das Zusammenspiel der codierten Proteine dar. Zur Analyse kortikaler Migrationen wurde in dieser Arbeit erstmalig die Histogrammanalyse nach In-utero-Elektroporation angewendet. Dazu wurden somatosensorische Kortexbereiche des Großhirns in unterschiedlichen Embryonalstadien manipuliert und die Ergebnisse in der Verteilung der fluoreszierenden Signale und der transfizierten Zellkörper verglichen. Es zeigte sich, dass die Verteilung der manipulierten Zellkörper, die durch Auszählung erfasst wurden, mit Histogrammberechnungen der Fluoreszenzen im Gewebeschnitt bei Transfektionen im letzten Viertel der Trächtigkeit gleiche oder annähernd ähnliche Ergebnisse erbrachten. Dieses neue Auswerteverfahren der neuronalen Migration durch Histogrammanalysen wurde in der hier vorgestellten Arbeit bei 2 wichtigen membranständigen Proteinen, dem PRG-1 und LPP-1 mit der Spleißvariante LPP-1a erfolgreich getestet. Bei der Erforschung molekularer Einflüsse in der Regulation des axonalen Auswachsens in der Hippocampusformation wurde das PRG-1 als beteiligtes Membranprotein vor einigen Jahren entdeckt. In dieser Dissertation wurde erstmalig die Migration neuronaler postmitotischer Zellen im somatosensorischen Kortexbereich des Großhirns unter Beeinflussung der Expression des membranständigen Proteins PRG-1 in der Embryonalphase untersucht. Dabei zeigte sich, dass bei einer verstärkten Produktion des Proteins durch gentechnische Veränderungen in den Vorläuferzellen mithilfe der In-utero-Elektroporation weniger transfizierte postmitotische Zellen im Vergleich zur Kontrolle in der kortikalen Platte aufzufinden waren. Der Großteil der transfizierten Zellen, die PRG-1 überexprimierten, waren in der ventrikulären und subventrikulären Zone vorzufinden. Bei einer zellulären Defizienz von PRG-1 waren nur wenige transfizierte, postmitotische Neurone in der Übergangsphase zwischen der subventrikulären und intermediären Zone. Dies stellt den Beginn der radialen Migration dar. Obwohl PRG-1 keine bekannte enzymatische Aktivität besitzt, zeigte sich der Hinweis, dass PRG-1 eine regulatorische Funktion in der Migration postmitotischer Neurone haben könnte. Im letzten Abschnitt dieser Arbeit wurde der Einfluss der Transfektion von LPP-1- und LPP-1a-codierenden Plasmiden auf die Neurogenese und die neuronale Migration untersucht. Beide Proteine dephosphorylieren aktiv Lipid-Phosphate und sind für die Entwicklung des zerebralen Kortex und die funktionelle Reifung der Neurone wichtig. Im Zuge dieser Arbeit zeigte sich, dass sowohl eine Herunter- als auch eine Heraufregulation von LPP-1 und LPP-1a zu einer annähernd gleichen Verteilung der transfizierten Zellen im somatosensorischen Kortex im Vergleich zur Kontrolle führte. Dies kann ein Hinweis sein, dass die Balance der Stoffwechselproduktkonzentrationen (LPA, S-1-P, C-1-P und LP) von LPP-1 und LPP-1a im Mikromilieu der umgebenen Zellen für die neuronale Migration postmitotischer Neurone im somatosensorischen Kortex von Bedeutung ist.