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Entwicklung eines Zellkultur-basierten Testverfahrens zur Evaluierung potentieller Wirkstoffe gegen Cryptosporidium parvum (2015)

Art

Hochschulschrift

Autor

Schupfner, Maja (WE 13)

Quelle

Berlin: Mensch und Buch Verlag, 2015 — III, 152 Seiten

ISBN: 978-3-86387-603-6

Verweise

URL (Volltext): https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/2560

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Institut für Parasitologie und Tropenveterinärmedizin

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Abstract / Zusammenfassung

Cryptosporidiose ist eine sowohl bei Menschen als auch bei Tieren weltweit auftretende gastrointestinale Infektion, die durch das zoonotische Protozoon C. parvum und weitere Vertreter derselben Gattung verursacht wird. Der klinische Verlauf einer durch C. parvum induzierten Darminfektion ist eng mit dem Immunstatus des Wirtes assoziiert. Bei immunkompetenten Personen tritt als Folge einer Infektion mit diesem Erreger in der Regel eine akute, selbstlimitierende Durchfallerkrankung auf, die sich im Gegensatz dazu bei immundefizienten Personen zu einer chronischen und lebensbedrohlichen Erkrankungen mit unter Umständen (zusätzlichen) extraintestinalen Manifestationen entwickeln kann. Aber nicht nur in der Humanmedizin, sondern auch in der Veterinärmedizin zählt C. parvum zu den relevantesten parasitären Enteritiserregern. Durch ihr noch unausgereiftes Immunsystem sind in besonderem Maße Neonaten für eine Infektion mit diesem Erreger empfänglich und infizieren sich regelmäßig durch eine orale Aufnahme der übiquitär vorkommenden und gegenüber Umwelteinflüssen und Chemikalien sehr resistenten Dauerstadien (Oocysten). Als einer der Hauptverursacher der neonatalen Diarrhoe beim Kalb ist C. parvum verantwortlich für Verluste in der Kälberaufzucht, ein mit einem retardierten Wachstum einhergehendes vermindertes Schlachtgewicht und folglich Verursacher von erheblichen wirtschaftlichen Verlusten in der Landwirtschaft. Sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin existieren zugelassene Wirkstoffe zur Behandlung bzw. Pro- und Metaphylaxe einer humanen bzw. bovinen Cryptosporidiose. Leider erweist sich deren Einsatz nicht in allen Fällen einer Cryptosporidiose als effektiv, so dass uneingeschränkt wirksame Chemotherapeutika bis heute nicht verfügbar sind, aber dringend benötigt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Methode zur Evaluierung einer anticryptosporidialen Wirksamkeit potentieller bis dato noch nicht überprüfter Wirkstoffe etabliert. Bei dem als „C. parvum Inhibitionsassay“ bezeichneten Testverfahren handelt es sich um eine Kombination aus einer in vitro Kultivierung von C. parvum in HCT-8 Zellen und einer quantitativen real-time PCR (qPCR). Die qPCR ermöglichte eine relative Quantifizierung der Erregerentwicklung unter Wirkstoffeinfluss, so dass eine Aussage zu einer potentiell anticryptosporidialen Wirksamkeit der untersuchten Substanzen getroffen werden konnte. Als Zielsequenz fungierte hierbei ein 255 bp umfassender Abschnitt der cryptosporidialen 18S rDNA, dessen Gehalt in jeder einzelnen Probe anhand einer internen Kontrolle normiert wurde. Als interne Kontrolle wurde eine 189 bp umfassende Sequenz innerhalb des zellulären (humanen) 18S rDNA Gens verwendet, deren Gehalt in den einzelnen Proben anhand einer zweiten qPCR ermittelt wurde. Insgesamt wurden 51 Wirkstoffe in mindestens drei verschiedenen Konzentrationen überprüft. Zwei vielversprechend erscheinende Wirkstoffe, ein heterozyklisch substituiertes 1,2,4-Triazin (BAY-AB24992) und ein substituiertes Benzimidazol (BAY-AF76184), wurden eingehender untersucht. Ihr mittels des C. parvum Inhibitionsassays überprüftes Konzentrationsspektrum umfasste insgesamt acht Verdünnungsstufen und selbige Konzentrationen wurden ebenfalls mittels eines Lactatdehydrogenase (LDH)-Assays und eines WST-1-Assays auf zytotoxische und zytostatische Effekte auf die gewählte Wirtszelllinie untersucht. Für die Substanz BAY-AF76184 konnte eine gute konzentrationsabhängige Wirksamkeit gegen C. parvum mit Inhibitionen des cryptosporidialen Wachstums im Größenbereich von maximal 97 % gezeigt werden. Der ermittelte EC50-Wert belief sich auf 2,37 μM. Obgleich für diesen Wirkstoff auch konzentrationsabhängige antiproliferative und zytotoxische Effekte auf die HCT-8 Zelllinie nachgewiesen werden konnten, ist eine weitere Überprüfung in niedrigen Dosierungen in Tiermodellen angeraten. Selbst sehr niedrige Wirkstoffkonzentrationen in Höhe von 4,46 μM, die nicht mehr mit zytostatischen Effekten und einer nur sehr geringen Zytotoxizität assoziiert waren, erzielten in vitro noch Wachstumsinhibitionen von C. parvum im Größenbereich von ca. 78 %, weshalb diese Substanz trotz seiner unerwünschten Eigenschaften durchaus als vielsprechend gelten kann. Auch für BAY-AB24992 scheint eine nachfolgende in vivo Überprüfung empfehlenswert. Zwar war für diese Substanz keine Konzentrationsabhängigkeit nachweisbar und in vitro bewirkten nur die vier höchsten Konzentrationen eine über 60%ige Wachstumsinhibition von C. parvum (ca. 71 bis 88 %), allerdings konnten für diesen Wirkstoff keinerlei antiproliferative Effekte und auch nur eine sehr geringe Zytotoxizität nachgewiesen werden. Insgesamt betrachtet stellt das hier etablierte C. parvum Inhibitionsassay eine Methode dar, die eine schnelle und zuverlässige parallele Überprüfung mehrerer Substanzen auf ihre Wirksamkeit gegen das Protozoon C. parvum ermöglicht. Es ist folglich dazu geeignet, ethisch bedenkliche, kostenintensive und arbeitsaufwendige Tierversuche zumindest partiell zu ersetzten. Obgleich von einer attestierten Wirksamkeit in vitro nicht zwangsläufig auf eine Wirksamkeit in vivo geschlossen werden kann, so eignet sich ein Zellkultur-basiertes Testverfahren dennoch zur Vorselektion solcher Wirkstoffe, die in nachgeschalteten Tierversuchen mit einer größeren Wahrscheinlichkeit positive Ergebnisse erzielen könnten.