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Untersuchungen zur Haploidspezifität des t-Komplex-Responders bei der nicht-Mendelschen Vererbung in der Maus (2013)

Art

Hochschulschrift

Autor

Schöfisch, Karina (WE 12)

Quelle

Berlin: Mensch und Buch Verlag, 2013 — XII, 134 Seiten

ISBN: 978-3-86387-380-6

Verweise

URL (Volltext): https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/12814

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Abstract / Zusammenfassung

Die nicht-Mendelsche Vererbung des t-Haplotyps von heterozygoten Mausmännchen an ihre Nachkommen ist unter der Bezeichnung Transmission Ratio Distortion bekannt. Der t-Haplotyp, eine abweichende Form des t-Komplexes, erstreckt sich über fast ein Drittel des Mauschromosoms 17 und codiert mehrere Distortergene und ein Respondergen, die in der Spermatogenese zur Ausbildung von zwei verschiedenen Spermienpopulationen führen. Die früh exprimierten Distorter wirken auf Signalkaskaden einer Spermienmotilitätskinase, Smok1, und haben eine negative Wirkung auf die Motilität aller Spermien, während der Responder diese Situation nur in Spermien, die das Respondergen tragen, wieder ausgleicht. Dies verschafft den sogenannten t-Spermien einen Vorteil bei der Befruchtung und führt zu der ungewöhnlich hohen Vererbung. Vorangegangene Arbeiten haben gezeigt, dass ein responderbasiertes Transgen haploidspezifische Transkriptexpression aufweist, das heißt, die mRNA ist haploidspezifisch auf die Hälfte der runden Spermatiden begrenzt, obwohl diese Zellen durch Zellbrücken miteinander verbunden sind und ein Austausch von Genprodukten stattfinden kann. Außerdem ist das Responderprotein nur im Flagellum elongierter Spermien detektierbar, das heißt, die Translation findet erst in späten Spermatogenesestadien statt. Dies zeigt, dass translationelle Regulation in der Expression des Respondergens involviert ist und eine datenbankbasierte Analyse konnte bereits mögliche, regulatorische Elemente der translationellen Kontrolle in der 5’- untranslatierten Region (5’-UTR) des Respondertranskripts aufdecken. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene, responderbasierte Transgene kloniert, aus denen transgene Mäuse generiert wurden, um die Haploidspezifität der t-Komplex Responders in vivo auf Transkript- und Proteinebene durch in situ Hybridisierung und Immunhistochemie sowie funktionell in einem Vererbungstest zu untersuchen. Um die Bedeutung von regulatorischen Elementen der 5’-UTR für die Responderexpression zu klären, wurden unterschiedliche Deletionskonstrukte generiert und die Expressionsanalyse in vivo zeigte, dass die 5’-UTR tatsächlich in der Transkriptlokalisation involviert war. Sobald die selben 5’-UTR-Deletionen in Kombination mit der codierenden Region des Responders verwendet wurden, konnte gezeigt werden, dass die codierende Sequenz für die Transkriptstabilität und erfolgreiche Translation wichtig war, allerdings nur zusammen mit mindestens dem letzten Drittel der 5’-UTR. Schließlich konnte bei Untersuchungen der spezifischen Subdomänen innerhalb der codierenden Region des Responders durch Verwendung von Deletionskonstrukten in dieser Region verdeutlicht werden, dass eine erfolgreiche Translation des Gens von dem Vorhandensein der regulatorischen Subdomäne in der codierenden Sequenz abhängig war. Um das Ergebnis der Deletionsuntersuchungen auch funktionell zu bestätigen, wurden transgene Mäuse mit den Deletionen in der codierenden Region in einem Transmissionstest eingesetzt, bei dem die jeweilige Vererbungsrate des Transgens in Anwesenheit von Distortern erfasst wurde. Im Hinblick auf Transmission Ratio Distortion war dieser Vererbungstest nicht sehr aussagekräftig und damit nicht ausreichend, um zu beantworten, welche Responderuntereinheit allein ausreichende Responderaktivität hat. Zusätzlich offenbarte der Test, dass die gewählte Integrationsstrategie für Transgene möglicherweise Defizite aufweist. Zur Generierung von transgenen Mäusen wurde ein Rekombinase vermittelter Kassettenaustausch transgener Konstrukte als Einzelkopie in den ColA1 -Locus von embryonalen Stammzellen verwendet, aber der Integrationsort selbst zeigte im Verlauf dieser Arbeit jedoch unerwartete Positionseffekte, die zu niedriger oder komplett abwesender Expression der Transgene führten und die Ergebnisse der in situ Hybridisierung, der Immunhistochemie und des Transmissionstests beeinflussten. Das Vorhaben der Arbeit war die regulatorischen Elemente des Respondertranskripts zu identifizieren, die bedeutsam für die spezielle Expression diese Gens sind, um diese bei der Manipulation der Expression anderer Gene in der Maus oder anderen Spezies einsetzen zu können. Diese Arbeit konnte zeigen, dass die 5’-UTR des Respondergens in der Transkriptlokalisation involviert ist, während die codierende Region, allerdings nur in Kombination mit der 5’-UTR, die Transkriptstabilität und Translation kontrolliert. Somit verdeutlichen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die posttranskriptionelle Regulation des Responders sehr komplex ist und auf verschiedene regulatorische Elemente innerhalb des Transkripts angewiesen ist und dies erschwert eine mögliche Anwendung deutlich.