Publication Database

Identifizierung und Nachweis von tier- und gewebespezifischen Markern in tierischen Nebenprodukten und Futtermitteln zur Eindämmung der Übertragung der transmissiblen spongiformen Enzephalopathie TSE (2013)

Art

Hochschulschrift

Autor

Kreuz, Grit (WE 4)

Quelle

Berlin: Mensch und Buch Verlag, 2013 — XI, 129 Seiten

ISBN: 978-3-86387-306-6

Verweise

URL (Volltext): https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/5696

Kontakt

Institut für Tierernährung

Königin-Luise-Str. 49
14195 Berlin
+49 30 838 52256
tierernaehrung@vetmed.fu-berlin.de

Abstract / Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit werden neue analytische Methoden für den Nachweis von tierischen Proteinen in Nebenprodukten und Futtermitteln beschrieben. Aufgrund der Durchsetzbarkeit von Rechtsvorschriften zur Bekämpfung der transmissiblen spongiformen Enzephalopathie (TSE) der Europäischen Union und hinsichtlich geplanter Lockerungen dieser bedarf es dringend der Entwicklung speziesspezifischer Nachweismethoden, um insbesondere den Eintrag bovinen Materials in die Futtermittelkette zu verhindern. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Validierung immunologischer Methoden zum speziesspezifischen Nachweis prozessierter tierischer Proteine in Futtermitteln als Alternativmethoden zur Mikroskopie. Dafür wurden zunächst verschiedene mögliche Gewebemarker tierischen Ursprungs identifiziert und auf ihre potentielle Eignung anhand von Sequenzvergleichen und Literaturrecherchen überprüft. Aufgrund der extremen Stabilität und Hitzeresistenz, der artspezifischen Sequenzunterschiede und des reichlichen Vorhandenseins in Fleisch- und Knochenmehlen hat sich dabei das Knochenprotein Osteocalcin als besonders geeignet erwiesen und wurde daher als Zielprotein für die zu entwickelnden Nachweissysteme ausgewählt. Ein Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag in der Entwicklung und Optimierung eines Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA), welcher die Detektion bovinen Materials ermöglichen sollte. Um dabei die Assay-Spezifität auf Rinder zu beschränken, wurden sowohl spezies- als auch sequenzspezifische polyklonale Antikörper gegen bovines Osteocalcin generiert und auf ihre Eignung getestet. In Verbindung mit einem kommerziellen gegen Osteocalcin gerichteten monoklonalen Antikörper konnte daraufhin ein Sandwich-ELISA für den Nachweis bovinen Osteocalcins entwickelt werden. Auf die Methodik des ausgearbeiteten ELISA aufbauend sollte hiernach eine real-time-immuno-PCR (RT-iPCR) als weitere Strategie für den sequenzspezifischen Osteocalcin-nachweis entwickelt werden. Dabei sollte verifiziert werden, ob eine höhere Sensitivität der Detektion bovinen Osteocalcins im Vergleich zu dem entwickelten Sandwich-ELISA erreicht werden könnte. Abschließend wurde untersucht, inwiefern ein immunologisches Detektionssystem für bovines Osteocalcin mittels Phage-Display-Methoden generierbar ist. Dafür wurde, ausgehend von einer Sequenzanalyse, eine spezifische Aminosäuresequenz bovinen Osteocalcins für die Isolierung spezifisch bindender Phagen gewählt. Isolierte Phagen mit positiver Bindungsaffinität gegen bovines Osteocalcin konnten dann in einem ELISA zum Nachweis bovinen Osteocalcins eingesetzt und anhand einer DNA-Sequenzierung das interagierende Peptid charakterisiert werden. Nach der Optimierung einzelner Arbeitsschritte wurde die Leistungsfähigkeit für die genannten Systeme untersucht. Dabei wurden die Möglichkeiten und Grenzen der entwickelten Nachweismethoden anhand von Referenzmaterialien und handelsüblichen Proben aufgedeckt. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl der entwickelte ELISA, als auch die RT-iPCR den Nachweis bovinen Osteocalcins mit einer Sensitivität von 1 ng Osteocalcin bei ausgeprägter Spezifität ermöglichen. Für beide Systeme konnte außerdem eine bemerkenswerte Nachweisgrenze von 0,1 % bovinen Fleisch- und Knochenmehls in pflanzlichen Futtermitteln ermittelt werden. Dabei wurde ein bovines Fleisch- und Knochenmehl genutzt, welches sogar bei 145 °C behandelt wurde, was über den gesetzlich festgelegten Forderungen liegt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass durch den Einsatz einzelner in vitro selektierter Phagenklone in einem direkten ELISA sowohl reines bovines Osteocalcin, als auch ein hoch prozessiertes bovines Fleisch- und Knochenmehl detektiert werden konnte. Die Ergebnisse belegen die Möglichkeit des speziesspezifischen, selektiven Nachweises von tierischen Proteinen in Futtermitteln, basierend auf bekannten Osteocalcinsequenzen. Der hier beschriebene Osteocalcin-Assay könnte die Grundlage für ein validiertes Nachweisverfahren als Werkzeug für die Sicherstellung und Überprüfung der Einhaltung des Verfütterungsverbots werden und somit zu einer Verbesserung der Bekämpfung der Transmissiblen spongiformen Enzephalopathien führen. Ein weitreichender Einsatz der entwickelten ELISA- Methode für den speziesspezifischen Nachweis tierischer Proteine in Futtermitteln anderer Spezies ist denkbar.