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Expressionsanalyse, zelluläre Lokalisierung und proteinbiochemische Charakterisierung des porzinen CLCA-Homologen pCLCA4a (2013)

Art

Hochschulschrift

Autor

Grötzsch, Tanja (WE 12)

Quelle

Berlin: Mensch und Buch Verlag, 2013 — VIII, 125 Seiten

ISBN: 978-3-86387-270-0

Verweise

URL (Volltext): https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/1978

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Abstract / Zusammenfassung

Die CLCA (engl.: chloride channel regulators, calcium-activated) - Familie umfasst eine Gruppe heterologer Proteine, die funktionell möglicherweise eine Ca2+-abhängige Chloridleitfahigkeit an epithelialen Grenzflachen induzieren. Die CLCA-Proteine stellen dabei selbst keine echten Kanäle dar, sondern scheinen, neuen Erkenntnissen nach, eine indirekte Wirkung auf bislang unbekannte Proteine zu haben. Der humane Vertreter hCLCA4, der überwiegend im Intestinaltrakt und im Respirationstrakt exprimiert wird, scheint zudem eine bedeutende Rolle bei der Zystischen Fibrose (engl.: cystic fibrosis, CF) einzunehmen. Seine möglichen Funktionsmechanismen sind jedoch bislang noch unerforscht. Sein muriner Orthologe mCLCA6 ist mit dem mCFTR-Chloridkanal im Kolonepithel kolokalisiert, was ebenfalls für eine potenzielle Rolle als Modulator der „alternativen Chloridleitfahigkeit“ bei der CF sprechen konnte. Betrachtet man jedoch das Expressionsmuster dieser beiden nahe verwandten Vertreter, fallen gravierende speziesspezifische Unterschiede auf, da mCLCA6 im Gegensatz zu hCLCA4 nicht im CF-relevanten Respirationsepithel exprimiert ist. Daraus resultierende Funktionsunterschiede dieser beiden CLCA-Orthologen müssen daher zu diesem Zeitpunkt angenommen werden. Die somit eingeschränkte Übertragbarkeit von Daten der einen Spezies auf die andere schränkt den Gebrauch von Tiermodellen bei der translationalen Erforschung humaner Krankheiten wie der CF erheblich ein. Das bislang als Tiermodell verwendete CF-Mausmodell zeigt phänotypisch starke Abweichungen gegenüber dem humanen CF- Phänotyp. Gerade die Hauptmanifestation der humanen CF in der Lunge, deren Auswirkung bei den meisten Betroffenen der Grund für den tödlichen Krankheitsverlauf ist, fehlt im murinen CF-Modell fast gänzlich. Dadurch ist der Modellcharakter der CF-Maus zur Erforschung dieser dramatischen Erkrankung erheblich limitiert. Jüngst ist es gelungen, CF-Schweinemodelle zu generieren, die den CF-Phänotyp des Menschen wesentlich besser widerzuspiegeln scheinen. Insofern verfolgte diese Forschungsarbeit das Ziel, den porzinen Orthologen zu hCLCA4 und mCLCA6, pCLCA4a, proteinbiochemisch zu charakterisieren und sein Expressionsmuster zu ermitteln, um so einen Vergleich zwischen den Spezies zu ermöglichen und eventuell bestehende speziesspezifische Unterschiede zwischen den Orthologen aufzudecken. RT-PCR-Analysen zur Klärung dieser Frage ermittelten eine mRNA-Expression im oberen Respirationstrakt, im Intestinaltrakt und, deutlich schwächer, auch im Auge und im Uterus. Mittels spezifischer, hier erzeugter anti-pCLCA4a-Antikorper wurde das pCLCA4a-Protein immunhistochemisch im bronchialen Zilienepithel des oberen Respirationstrakts und in der apikalen Bürstensaummembran im oberen Drittel der Zotten des gesamten Dünndarms nachgewiesen. Computergestützte Analysen zur Proteinstruktur und die proteinbiochemischen Untersuchungen mittels Westernblot weisen darauf hin, dass pCLCA4a einen ähnlichen sekretorischen Weg durch die Zelle nimmt wie mCLCA6. Demnach unterliegt auch pCLCA4a den CLCA- typischen Proteinmodifikationen in Form einer posttranslationalen Spaltung des Vorläuferproteins im Endoplasmatischen Retikulum in ein 110 kDa- aminoterminales Spaltprodukt und ein 52 kDa- bzw 42 kDa-carboxy-terminales Spaltprodukt und Glykosylierungen im Endoplasmatischen Retikulum und im Golgi- Apparat. Schließlich wird pCLCA4a offensichtlich zur apikalen Zellmembran zielgeleitet, wo es mit einer carboxyterminalen Transmembrandomane membranverankert vorliegt. Lediglich das aminoterminale Spaltprodukt des pCLCA4a-Proteins kann in den extrazellularen Raum abgegeben werden. Trotz einiger hier beobachteter speziesspezifischer Abweichungen des pCLCA4a- Expressionsmusters von dem seiner humanen und murinen Orthologen besteht offensichtlich eine beträchtlich größere Homologie des Expressionsmusters in CF-relevanten Organen zwischen hCLCA4 und pCLCA4a als zwischen hCLCA4 und mCLCA6. Dies stützt die Auffassung, dass CF-Schweinemodelle geeigneter zu sein scheinen, die Rolle von hCLCA4 bei der CF zu studieren, als es durch die Verwendung der heute verfügbaren Mausmodelle möglich wäre. Die Ergebnisse dieser Forschungsarbeit konnten damit zum Verständnis der speziesspezifischen Unterschiede beim CF-Phänotypen verhelfen und ermöglichen nachfolgenden Arbeiten, die Funktionsmechanismen dieser Proteine im transepithelialen Ionentransport und ihre möglichen Modulatorfunktionen bei Krankheiten wie der CF aufzudecken.