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Funktionelle und molekularbiologische Untersuchungen zum Glukosetransport am proximalen Jejunum des Schweins (2014)

Art

Hochschulschrift

Autor

Schenke, Kristina (WE 2)

Quelle

— VI, 110 Seiten

Verweise

URL (Volltext): https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/2639

Kontakt

Institut für Veterinär-Physiologie

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Abstract / Zusammenfassung

Schweine decken ihren Energiebedarf über kohlenhydratreiche Mahlzeiten. Dies erfordert hocheffiziente Mechanismen der Glukoseresorption im Dünndarm. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Glukoseaufnahme in das proximale Jejunum des Schweins bei höheren luminalen Konzentrationen (6 bis 20 mM) funktionell zu charakterisieren und ein systematisches Screening auf Glukosetransporter- mRNA im porzinen Jejunum sowie in weiteren für die Glukose-Homöostase wichtigen Organen durchzuführen. Für die Glukoseaufnahmestudien wurde der apikale Uptake von radioaktiv markierter Glukose in das Dünndarmepithel gemessen. Zusätzlich wurden der Kurzschlussstrom und die Leitfähigkeit mit Hilfe der Ussing-Kammer-Technik erfasst. Mögliche Wechselwirkungen der Glukoseresorption mit anderen zellulären Stoffwechselwegen (Glykolyse und Glukoneogenese) und eine mögliche Glukoseresorption über Endozytose wurden überprüft. Durch vergleichende Analysen der Aufnahme bzw. des Fluxes von radioaktiv markiertem Mannit wurde auch die Möglichkeit einer parazellulären Resorption überprüft. Außerdem wurde mittels Zweischritt-RT-PCR die mRNA verschiedener Glukosetransportproteine im proximalen Jejunum Leber, Niere und Skelettmuskulatur nachgewiesen. Bei einer Konzentration von 10 mM Glukose hemmten sowohl der kompetitive SGLT1-Hemmstoff Phlorizin (0,1 mM) als auch die GLUT-Hemmstoffe Phloretin (0,2 mM) und Cytochalasin B (0,2 mM) die Glukoseaufnahme in das Epithel. Nach 10- oder 20 minütiger Vorinkubation mit 10 mM Glukose konnte allerdings keiner der Hemmstoffe eine signifikante Hemmung der Glukoseaufnahme erzielen. Mit Hilfe des nach Glukosezugabe (10 mM) stattfindenden Kurzschlussstrom-Anstieges ließ sich eine Transportrate des SGLT1 von etwa 7,5 nmol Glukose pro cm2 und min errechnen. Die Hemmwirkung des Phlorizins auf die Glukoseaufnahme überstieg diesen Wert jedoch um ein Vielfaches. Chlorpromazin (20 µM), ein Hemmstoff der Clathrin-vermittelten Endozytose, führte zu einem Verschwinden der Phlorizin- und Phloretin- hemmbaren Glukoseaufnahme, während ein Kurzschlussstrom-Anstieg nach Glukosezugabe noch vorhanden war. Sowohl serosal appliziertes Phloretin (0,2 mM) als auch beidseitig angewendetes N-Acetyl-D-Glukosamin (20 mM), ein Hemmstoff der Hexokinase, führten bei einer Konzentration von 20 mM Glukose zu einer verminderten Glukoseaufnahme in das Epithel. Nach Verhinderung einer intrazellulären Laktatanreicherung durch Verwendung laktatfreier Pufferlösung und gleichzeitiger Hemmung der Laktatdehydrogenase mit Na-Oxamat (20 mM), war auch nach mehr als dreistündiger Vorinkubation mit Glukose (6 mM) eine Hemmwirkung von Phlorizin (0,1 mM) auf die Glukoseaufnahme nachweisbar, während mukosal appliziertes Phloretin (0,2 mM) keinen Effekt hatte. Bei Verhinderung der Glukosebildung aus Laktat durch Hemmung des Glukoneogenese- Schlüsselenzyms PEPCK mit 3-Mercaptopicolinsäure (0,2 mM) war ebenfalls nach mehr als dreistündiger Vorinkubation ein Effekt von Phlorizin (0,1 mM) jedoch nicht von Phloretin (0,2 mM) auf die Glukoseaufnahme (6 mM) nachweisbar. Über einen Zeitraum von 20 min erfolgten in Anwesenheit von Phlorizin (0,5 mM) und Phloretin (0,5 mM) die Glukose- und Mannitaufnahmen bei gleicher Konzentration (20 mM) in einem Verhältnis von etwa 1:0,65 zueinander, während deren Fluxe annähernd im Verhältnis 1:1 standen. Die Fluxe (jedoch nicht die Aufnahmen) von Glukose und Mannit korrelierten mit der Gewebeleitfähigkeit. Im Jejunum konnte die mRNA von SGLT1, GLUT1, GLUT2, GLUT5, GLUT7 und GLUT8 nachgewiesen werden; GLUT3, 4, 10 und 11 waren schwach detektierbar. Die Leber enthielt die mRNA von SGLT1, GLUT1, GLUT2 und GLUT8; GLUT3, 4, 5, 10 und 11 waren schwach detektierbar. Die Niere war positiv für SGLT1, GLUT1, GLUT2, GLUT5, GLUT8 und GLUT11; GLUT3, 4 und 10 waren schwach detektierbar. Die Skelettmuskulatur war positiv für den GLUT4; GLUT1, 3, 5, 8, 10 und 11 zeigten schwache Signale. Drei neue Gensequenzen porziner GLUT wurden identifiziert. Der SGLT1 und ein apikaler GLUT, wahrscheinlich der GLUT2 (Kellett-Hypothese), sind an der Glukoseaufnahme in das porzine Dünndarmepithel beteiligt. Der apikale GLUT wird durch den SGLT1 induziert und Clathrin-abhängig eingebaut. Er ermöglicht in den ersten Minuten nach Glukosezugabe eine Anreicherung von Glukose in der Zelle und wird danach inaktiv. Wird die Anreicherung von Glukose im Enterozyten durch intrazelluläre Glukoneogenese und verminderten basolateralen Efflux forciert, sinkt die apikale Glukoseaufnahme. Eine endozytotische Aufnahme von Glukose (oder Mannit) konnte nicht nachgewiesen werden. Es gibt jedoch Hinweise auf eine geringe parazelluläre Resorption und auf einen weiteren Aufnahmemechanismus für Glukose und Mannit. In den für die Glukosehomöostase wichtigen Organen Darm, Leber, Niere und Skelettmuskulatur werden mRNA für verschiedene Transportproteine mit einer gewissen Redundanz exprimiert.