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Die Bedeutung von P-Glykoprotein Pgp assoziierten Mechanismen der Resistenz gegenüber makrozyklischen Laktonen ML beim Pferdespulwurm Parascaris equorum (2014)

Art

Hochschulschrift

Autor

Janssen, Isa Jana Irina (WE 13)

Quelle

Berlin: Mensch und Buch Verlag, 2014 — III, 145 Seiten

ISBN: 978-3-86387-517-6

Verweise

URL (Volltext): https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/10485

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Institut für Parasitologie und Tropenveterinärmedizin

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Abstract / Zusammenfassung

Dem Einsatz von Anthelminthika wie den makrozyklischen Laktonen (MLs) kommt in der Tierhaltung eine bedeutende Rolle zu und ein Verlust ihrer Wirksamkeit kann neben den mit der Infektion verbundenen gesundheitlichen Beeinträchtigungen hohe wirtschaftliche Einbußen nach sich ziehen. Da mittelfristig nicht mit der Einführung neuer Antiparasitika zu rechnen ist, sollte auf den Erhalt der verfügbaren Anthelminthika ein besonderes Augenmerk gelegt werden. Die Voraussetzung hierfür ist die Kenntnis der zugrundeliegenden Resistenzmechanismen. Zu diesen ist im Fall der ML-Resistenz insbesondere die Aktivität der P-Glykoproteine (Pgps) zu zählen, die der Superfamilie der ATP-Binding-Cassette (ABC)-Transporter angehören. Die in die Membran integrierten Proteine dienen dem aktiven Transport von Molekülen und Veränderungen ihrer Struktur oder Anzahl können infolge der verminderten Verfügbarkeit am Wirkort die Effizienz eines Wirkstoffes beeinträchtigen. Bei dem zur Gruppe der MLs gehörenden Ivermectin (IVM) wurde die Eigenschaft als Pgp-Substrat bereits bei Säugerzellen nachgewiesen. IVM findet breite Anwendung bei der Behandlung parasitärer Infektionen, zu denen auch die Parascariose, eine Jungtiererkrankung der Equiden, gehört. Bei dem Erreger handelt es sich um einen Parasiten des Dünndarms, der hier zu Obstruktionen mit Todesfolge führen kann. Die Bekämpfung dieses weltweit z. T. mit hohen Prävalenzen anzutreffenden Parasiten wurde in den letzten Jahren zunehmend durch das Auftreten von Resistenzen gegenüber IVM erschwert. Die molekularen Hintergründe hierfür sind noch weitgehend ungeklärt und auch für die Diagnose resistenter Populationen sind keine Verfahren standardisiert. Aufgrund der Beobachtungen an anderen Nematoden hinsichtlich eines Zusammenhanges zwischen Pgps und der Resistenz gegenüber MLs wurden die vollständigen Sequenzen zweier putativer Pgps von P. equorum mit Hilfe degenerierter Primer und einer anschließenden RACE-PCR gewonnen. Phylogenetische Untersuchungen offenbarten diese als Orthologe von Caenorhabditis elegans Pgp-11 (PeqPgp-11) bzw. des nicht näher benannten Pgp CBG12969 von Caenorhabditis briggsae (PeqPgp-16). Die Aminosäuresequenzen beider Proteine weisen die Pgp-typischen Motive auf, die an der Substrat- und ATP-Bindung beteiligt sind. Der Vergleich einzelner Gewebe hinsichtlich ihrer Pgp-Expression mittels Real-time-RT-PCR ergab, dass die Peqpgp-11-Expression im Darm männlicher und weiblicher Individuen signifikant gegenüber den restlichen untersuchten Geweben erhöht war, wohingegen sich der Hautmuskelschlauch für Peqpgp-16 als das Gewebe der stärksten Expression erwies. Um mögliche Veränderungen, die mit der IVM- Resistenz bei P. equorum einhergehen, zu untersuchen, wurden außerdem die Pgp- Sequenzen mehrerer Populationen mit unterschiedlicher IVM-Suszeptibilität miteinander verglichen. Für PeqPgp-11 wurden im Rahmen einer SeqDoC-Analyse drei Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) ermittelt (Asp931Asn, Cys951Ser, Tyr978His), die jeweils zu einer Aminosäuresubstitution führten und mit der IVM-Suszeptibilität der Populationen korrelierten. Die quantitative Untersuchung zur Expression beider Pgps bei Eiern ließ dagegen keinen Schluss auf einen Zusammenhang mit dem Resistenzstatus zu. Als weiteres Entwicklungsstadium wurden präadulte Würmer in die Untersuchungen miteinbezogen: Eine Gruppe von Würmern mit verminderter IVMSuszeptibilität zeigte eine signifikant höhere Expression von pgp-11 gegenüber einer zufällig gewählten Gruppe. Neben diesen deskriptiven Beobachtungen an P. equorum wurde außerdem die Beteiligung der Pgps am Entgiftungsprozess bei dem Modellorganismus C. elegans untersucht, erstens, um Aussagen über den gleichzeitigen Verlust der Funktionalität sämtlicher Pgps am lebenden Organismus treffen zu können und zweitens, um die Bedeutung einzelner Pgps für den IVMTransport vergleichend darstellen zu können. IVM führte in Gegenwart des Pgp-Hemmers Verapamil zu einer geringen aber signifikanten Abnahme des EC50-Wertes (~2,5fach) gegenüber dem Wildtypstamm Bristol N2, wie sich anhand von verminderten Entwicklungsraten zeigte. Der Funktionsverlust einzelner Pgps ging dagegen mit einer Reduktion des EC50-Wertes um den Faktor 1,5-4,3 einher. Neben Pgp-14 zeigte der Verlust der pgp-11-Aktivität die größten Auswirkungen auf die Entwicklung. Die im Laufe dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse sprechen für die Beteiligung der Pgps an der Resistenz gegenüber IVM bei Nematoden. Dies wird sowohl anhand der Zunahme der Suszeptibilität nach dem Funktionsverlust einzelner bzw. aller Pgps bei C. elegans deutlich, als auch durch strukturelle und quantitative Veränderungen des Proteins in Abhängigkeit vom Resistenzstatus bei P. equorum. Eine besondere Rolle spielte in beiden Fällen pgp-11, dessen SNPs bei P. equorum vielversprechende Kandidaten für die Resistenzdiagnostik darstellen. Die Beurteilung ihrer Eignung erfordert die Untersuchung weiterer Spulwurmpopulationen mit bekanntem Resistenzstatus. Um diese zu erleichtern, wurde für zwei der drei SNPs bereits erfolgreich ein Pyrosequenzierungs-Assay etabliert. Des Weiteren besteht die Möglichkeit, die Bedeutung dieser SNPs durch die vergleichende heterologe Expression von Pgp-11 des suszeptiblen und des vermeintlich resistenten Genotyps in einem Modellorganismus zu ermitteln. Als solcher bietet sich aus vielerlei Hinsicht C. elegans an, u. a. auch, weil ein entsprechender pgp-11 Loss-of-function- Stamm, der die Durchführung eines Rescues erlaubt, hinsichtlich seiner IVM- Suszeptibilität schon näher charakterisiert wurde. Aus diesem Grund wurden bereits transgene Linien, die das PeqPgp-11 des vermeintlich resistenten Genotyps exprimieren, sowie eine Kontrolllinie erzeugt. Erste vergleichende Analysen zwischen diesen verschiedenen Linien führten zu vielversprechenden Ergebnissen.