Fachbereich Veterinärmedizin


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    Molekulare Untersuchung des Ratten-Cytomegalovirus CD200-Homologs (2012)

    Art
    Hochschulschrift
    Autor
    Westerholt, T. (WE 5)
    Quelle
    Berlin: Mensch & Buch Verlag, 2012 — 144 Seiten
    ISBN: 978-3-86387-115-4
    Verweise
    URL (Volltext): http://www.diss.fu-berlin.de/diss/servlets/MCRFileNodeServlet/FUDISS_derivate_000000010843
    Kontakt
    Institut für Virologie

    Robert-von-Ostertag-Str. 7-13
    Gebäude 35
    14163 Berlin
    +49 30 838 51833
    viro@zedat.fu-berlin.de

    Abstract / Zusammenfassung

    In der vorliegenden Arbeit erfolgte eine molekulare Analyse des RCMV CD200-Homologes (vCD200). Die Entdeckung und Charakterisierung viraler Homologe zu zellulären Genen ist sowohl aus humanmedizinischer als auch veterinärmedizinischer Sicht ein wichtiger Aspekt der virologischen Forschung. Dies trifft insbesondere dann zu, wenn virale Proteine immunmodulatorische Eigenschaften besitzen. Die Beschreibung gerade solcher Mechanismen verbessert das Verständnis der Virus-Wirt-Interaktion und stellt eine Grundlage für die Entwicklung neuer antiviraler Substanzen dar. Voraussetzung solcher Untersuchungen in vivo ist das Vorhandensein eines Modellsystems, wozu in der vorliegenden Arbeit das RCMV genutzt wurde, sowie eine Vielzahl virologischer und immunologischer Werkzeuge für eine umfangreiche Genanalyse.
    Das RCMV CD200-Homolog (vCD200) bindet an einen inhibitorischen Rezeptor (CD200R), der auf Makrophagen exprimiert wird. Bereits untersuchte virale CD200-Homologe führten zur Formulierung einer Hypothese: nach Infektion von Zellen mit RCMV führt die Bindung des vCD200 an den CD200R zu einer verminderten Aktivierung von Makrophagen und damit zu einer geringeren Produktion des Enzyms iNOS innerhalb dieser Zellen. Dies resultiert in einer verminderten NO-Ausschüttung durch die Makrophagen, und somit einer verringerten Entzündungsreaktion im umliegenden Gewebe. Infolgedessen wird die Replikation der Viren durch verminderte inflammatorische Stimuli im Gewebe erleichtert.Im ersten Teil der Arbeit wurde eine RCMV CD200-Revertante (RCMV-revCD200) zur bereits bestehenden RCMV CD200-Deletionsmutante (RCMV-ΔCD200) des RCMV-E Wildtyp-Virus (RCMV-wt) hergestellt. Diese wurde in vitro charakterisiert und wies die gleichen Eigenschaften wie RCMV-wt auf. Alle drei Viren zeigten auf Rattenembryofibroblasten (REF) vergleichbare Wachstumseigenschaften.
    Im Anschluss wurden Lysate einer REF/Makrophagen co-Kultur mithilfe des Western Blot untersucht. Dazu wurden zunächst REF mit den Viren RCMV-wt, RCMV-revCD200 und RCMV-ΔCD200 infiziert, und 24 h später die gleiche Anzahl Makrophagen zu den infizierten REF gegeben. Weitere 24 h später wurden die Lysate aus dem Zellgemisch gewonnen. Das Lysat der co-Kultur, die mit RCMV-ΔCD200 infiziert worden war, zeigte, entsprechend der Hypothese, eine dezent höhere iNOS-Expression im Vergleich zu den anderen Lysaten.
    Im zweiten Teil der Arbeit wurden Methoden (TaqMan-PCR und Durchflusszytometrie) zum Nachweis und zur Quantifizierung der Gene CD200, vCD200, CD200R und iNOS etabliert. Es wurde Gewebematerial (peritoneale Exsudatzellen und Milz) aus Ratten, die mit den Viren RCMV-wt, RCMV-revCD200 und RCMV-ΔCD200 infiziert worden waren, ex vivo untersucht.
    Entgegen der in der Hypothese formulierten Annahme zeigten die peritonealen Exsudatzellen von Tieren, die mit RCMV-wt oder RCMV-revCD200 infiziert worden waren, im Vergleich zu den Zellen von Tieren, die mit RCMV-ΔCD200 infiziert worden waren, keine verringerte iNOS-Produktion. Das gleiche gilt auch für die Untersuchungen der Milz der Tiere. Eine Transkription der Gene vCD200, CD200 und CD200R konnte in den untersuchten Geweben nachgewiesen werden. Durch Quantifizierung des Virushüllproteins Glykoprotein B konnte eine vergleichbare Viruslast aller infizierten Tiere zwei und sechs Tage nach Infektion gezeigt werden. Mithilfe der Virustitration konnte zwei Tage nach Infektion Virus in der Milz und Leber infizierter Tiere nachgewiesen werden.
    Einen überraschenden Befund stellte die im Rahmen einer immunhistochemischen Färbung durchgeführte Betrachtung der Expression der MHC-Klasse-II-Moleküle in der Milz der Tiere dar. Die Milz-Schnitte zeigten, dass alle mit RCMV-ΔCD200 infizierten Tiere eine deutlich stärkere Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen aufwiesen, als mock-infizierte oder mit RCMV-wt und RCMV-revCD200 infizierte Tiere.