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Etablierung eines direkten Kokultur-Modells zur Analyse der Interaktion zwischen mikrovaskulären Endothelzellen und epidermalen Keratinozyten (2012)

Art

Hochschulschrift

Autor

Sarcev, Andjela (WE 1)

Quelle

Berlin: Mensch & Buch Verlag, 2012 — 179 Seiten

ISBN: 978-3-86387-164-2

Verweise

URL (Volltext): https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/11538

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Institut für Veterinär-Anatomie

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Abstract / Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit wurden drei direkte in vitro-Kokultur-Modelle aus Endothelzellen und Keratinozyten, die das Studium der Zell-Zell-Interaktion ermöglichen, entwickelt und etabliert. Im Fokus der Untersuchungen standen des Weiteren die Identifizierung der Zelltypen und eine morphologische Charakterisierung. Die zelluläre Interaktion zwischen den Keratinozyten und den Endothelzellen ist vor allem für die Gewebehomöostase im bovinen Zehenendorgan von entscheidender Bedeutung und nimmt somit in der Pathogenese von Klauenerkrankungen eine zentrale Stellung ein.
Hierfür wurden die direkten Kokulturen unter denselben standardisierten Kultivierungsbedingungen in drei unterschiedlichen Ansätzen zusammengeführt, die im Rahmen dieser Arbeit als Kokultur-System 1 (K+E), Kokultur-System 2 (E+K) und Kokultur- System 3 (Suspension) benannt wurden. Im Kokultur-System 1 (K+E) wurde zunächst ein subkonfluenter Monolayer aus Keratinozyten auf den mit Kollagen Typ I beschichteten Kulturgefäßoberflächen kultiviert, der im weiteren Sinne die Aufgabe eines „feeder layers“ erfüllen sollte. Zu untersuchen war, ob bereits adhärente im subkonfluenten Monolayer liegende Keratinozyten einen Einfluss auf die Adhärenz und folgende Differenzierung der Endothelzellen ausübten. Im umgekehrten Fall war im Kokultur-System 2 (E+K) zu untersuchen, inwieweit Keratinozyten im Zuge ihrer Adhärenz und Migration auf die Differenzierung bereits in subkonfluenter Monokultur befindende Endothelzellen Einfluss nehmen. Das Ziel der Untersuchungen im Kokultur-System 3 (Suspension) war zu beobachten, wie Endothelzellen und Keratinozyten, die zum selben Zeitpunkt in Kultur gebracht wurden, sich in der Adhärenz und Differenzierung gegenseitig beeinflussen. Die Einsaat der Zellen im Kokultur-System 3 erfolgte in Suspension, somit wurde eine zufällige Verteilung der Zelltypen auf dem Boden der Kulturgefäßoberfläche erreicht. Die Kokulturen wurden im Langzeitmodell jeweils auf beschichteten Glasplättchen beziehungsweise Millicell®-PCF-Filtereinsätzen phasenkontrastmikroskopisch beziehungsweise transmissionselektronenmikroskopisch angezüchtet. Die Kultivierung aller Kokultur-Systeme erfolgte in dem Erhaltungsmedium DMEM+. Gemäß des Versuchaufbaus der Kokultur-Systeme 1 (K+E) und 2 (E+K) wurden die Keratinozyten und die Endothelzellen in Monokultur jeweils über 24 Stunden in dem entsprechenden Selektivmedium inkubiert (s. 3.2).
In allen direkten Kokultur-Systemen konnten Endothelzellen und Keratinozyten erfolgreich kokultiviert werden. Die Endothelzellen zeigten in allen Kokultur-Systemen Angiogenese-artige Strukturen, die den charakteristischen Merkmalen in Form der Aussprossung, linearer Aneinanderreihung und der Ausbildung Kapillar ähnlicher Strukturen in vitro ähneln (Stadien- Einteilung gemäß Bahramsoltani, 2003; Käßmeyer, 2006). Die unvollständig differenzierten Keratinozyten zeigten eine stabile Adhärenz auf den mit Kollagen Typ I, einer Komponente der interstitiellen Matrix, beschichteten Glasplättchen und Millicell®-PCF-Filtereinsätzen. Charakteristisch für die Keratinozyten der Kokultur-Systeme 1 bis 3 (K+E, E+K, Suspension) war die Bildung einer mehrlagigen Zellschicht. Nach der vierwöchigen Langzeitkultivierung entstand in allen Kokultur-Systemen eine mehrlagige Kokultur aus Endothelzellen und Keratinozyten.
Durch die immunzytochemische Markierung mit einem Antikörper gegen Zytokeratin 14 (CK14) wurden die epidermalen Keratinozyten im Kokultur-System 2 (E+K) identifiziert. Ein Antikörper gegen Zytokeratin 19 (CK19) diente als Marker für die mikrovaskulären Endothelzellen in den auf Glasplättchen kultivierten Kokultur-Systemen 1 (E+K) und 3 (Suspension).
In den transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchungen erfolgte die Identifizierung der Endothelzellen und Keratinozyten in der frühen Phase der Kultivierung anhand der Lokalisation der Zellen gemäß des Versuchaufbaus des entsprechenden Kokultur-Systems, während in der späten Phase der Kultivierung spezifische morphologische Merkmale eine Identifizierung und Charakterisierung der Zellen ermöglichten. Dabei wurden innerhalb endothelialer Zellkolonien in den Kokultur-Systemen 1 (E+K) und 3 (Suspension) Lumen umschließende Kapillar-ähnliche Strukturen aus Endothelzellen beobachtet. Die durch überlappende Zellenden benachbarter Endothelzellen formierten Hohlräume waren teils mit Zellfragmenten oder elektronenoptisch leer. Im Kokultur-System 2 (E+K) formierten die Endothelzellen eine mehrlagige Zellansammlung, die gekennzeichnet war durch ein Netzwerk aus reich verzweigten Zellen. Des Weiteren zeigten sich Anzeichen für intussuszeptionelle Remodellierung der entstandenen Hohlräume. Die Keratinozyten bildeten in allen Kokultur-Systemen (E+K, K+E, Suspension) eine mehrlagige Zellschicht aus, auf denen die Endothelzellkolonien lokalisiert waren. Charakteristisch für die Keratinozyten war ihre stabile Adhärenz auf den beschichteten Filtermembranen. Transmissionselektronenmikroskopisch konnte eine eindeutige Kompartimentierung durch Ausbildung eines erweiterten mit fibrillärem Material gefüllten extrazellulären Spaltraums zwischen den Endothelzellen und den Keratinozyten beobachtet werden.
Resultierend aus den eigenen Beobachtungen scheinen Keratinozyten einen zentralen regulatorischen Einfluss auf die endotheliale Morphogenese auszuüben. Daher sind diese Kokultur-Systeme besonders für weitere Untersuchungen endothelial-epidermaler Regulationsmechanismen geeignet. In künftigen Untersuchungen zur Pathogenese von Klauen- und Hufrehe verspricht der Einsatz der hier entwickelten Kokultur-Systeme neue Erkenntnisse zu den Mechanismen im Initialstadium der Erkrankung.