Fachbereich Veterinärmedizin


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    Das Infektiöse Bronchitis-Virus (IBV):
    molekularbiologische Untersuchungen zur Diagnostik und zum Vorkommen sowie zur Pathogenität des Genotyps IBV QX in spezifisch pathogenfreien (SPF)-Broilern (2012)

    Art
    Hochschulschrift
    Autor
    Qaudros, Valter Leonardo de
    Quelle
    Berlin: Mensch & Buch Verlag, 2012 — 141 Seiten
    ISBN: 978-3-86387-116-1
    Verweise
    URL (Volltext): http://www.diss.fu-berlin.de/diss/servlets/MCRFileNodeServlet/FUDISS_derivate_000000010842
    Kontakt
    Institut für Geflügelkrankheiten

    Königsweg 63
    14163 Berlin
    +49 30 838 62676
    gefluegelkrankheiten@vetmed.fu-berlin

    Abstract / Zusammenfassung

    Zum universellen und routinemäßigen Nachweis des Infektiösen Bronchitis Virus (IBV) wurde im ersten Teil der vorliegenden Doktorarbeit eine duplex Real-time Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-qPCR) unter Verwendung einer heterologen internen Kontrolle (IK) etabliert. Dabei ermöglichte die Lokalisation der IBV spezifischen Primer und Sonde innerhalb hochkonservierter Bereiche des Matrixprotein- Gens eine sichere Detektion verschiedener IBV Genotypen und Stämme. Als IK diente eine enhanced green fluorescent protein (EGFP) in vitro RNA. Durch Zugabe der IK direkt zum Probenmaterial vor der extraktionkonnten falsch negative Ergebnisse auf Grund fehlerhafter RNA-Extraktion und / oder infolge von PCR Inhibitoren sicher ausgeschlossen werden. Bei der Überprüfung der Sensitivität anhand eines RNA in vitro Standards ergab sich eine Nachweisgrenze von 20 Kopien/Reaktion. Die Spezifität des Verfahrens wurde durch Untersuchung weiterer viraler bzw. bakterieller geflügelrelevanter Atemwegserreger und SPF Trachealtupfernproben von SPF Huhnern belegt. Die diagnostische Anwendbarkeit des Testverfahrens wurde darüber hinaus durch Untersuchung von Feldproben bestätigt. Dabei konnte die IK in IBV negativen Feldproben sicher amplifiziert werden, während sich bei IBV positiven Proben kein negativer Einfluss auf die IBV Amplifikation ergab.
    Die Genotypisierung nachgewiesener IBV Stämme erfolgte in einem ersten Schritt anhand zweier typspezifischer RT-PCRs zum Nachweis von IBV 4/91 und IBV QX. Zur weiteren Differenzierung wurde ein System auf Basis verschiedener RT-PCRs und nested- PCRs, die verschiedene Fragmente innerhalb des S1 Protein Gens amplifizieren, mit nachfolgender Restriktionsenzymanalyse (REA) und Sequenzanalyse entwickelt. Bei der Untersuchung von Feldproben konnten mittels des entwickelten Differenzierungssystems neben IBV 4/91 und QX verschiedene Vertreter des Massachusetts Genotyps als auch der Genotyp D274 erfolgreich differenziert werden.
    In zweiten Teil der Arbeit erfolgte eine epidemiologische Auswertung des im Rahmen der IBV Routinediagnostik in den Jahren 2004 bis 2009 eingesandten Probenmaterials. Über den gesamten Untersuchungszeitraum hinweg wurde IBV in 42,5 % der untersuchten Proben nachgewiesen, wobei eine Unterscheidung zwischen Feld- und Impfstämmen nicht erfolgen konnte. Bei Analyse der jährlichen Nachweisraten waren insbesondere Untersuchungsgründe als auch untersuchte Nutzungsrichtungen zu berücksichtigen. So korrelierte die relativ hohe Nachweisrate im Jahr 2009 insbesondere mit der hohen Nachweisrate bei Broilern. Eine weitere Analyse der zurzeit wichtigsten in Deutschland zirkulierenden Genotypen IBV 4/91 und QX unterstreicht die derzeit besondere Bedeutung des Gesnotyps IBV QX, der in mehr als der Hälfte der positiven Einsendungen mit insgesamt eher steigender Tendenz detektiert werden konnte. Davon waren in besonderem Maße Broilerbestände und erst zu Ende des Untersuchungszeitraums auch vermehrt Legehennenbestände betroffen. Für den Genotyp IBV 4/91 zeigte sich dagegen zu Ende der Untersuchungen ein deutlicher Rückgang des Anteils positiver Proben insbesondere bei Legehennen.
    Im letzten Teil der Arbeit wurden in vivo Untersuchungen zur Pathogenität des Genotyps IBV QX bei SPF Broilerküken durchgeführt. Dabei waren nach okulonasaler Infektion sowohl klinisch als auch pathologisch anatomisch Anzeichen einer Nephritis zu beobachten, was eine Klassifizierung des Isolats als nephropathogenen Stamm erlaubte. Untersuchungen zur Ausbreitung des Virus im Organismus und zur Virusausscheidung mittels RT-qPCR belegten darüber hinaus den weiten Gewebstropismus als auch die schnelle Ausbreitung von IBV QX im Körper in Kombination mit einer wiederum schnellen Virustilgung in betroffenen Organen. Hinsichtlich der Virusausscheidung fand sich eine längere und mit höheren Viruslasten verbundene Ausscheidung über den Kot als über den Respirationstrakt. In Anbetracht Ihrer Diagnostiktauglichkeit sprechen diese Ergebnisse damit dafür, dass insbesondere zu einem späteren Zeitpunkt nach Infektion Kloakentupfer das beste Untersuchungsmaterial zum Nachweis von IBV QX darstellen. Organproben sind dagegen nur in einem relativ schmalen Zeitfenster zur Diagnostik geeignet. Dabei ist die RTqPCR ein geeignetes diagnostisches Verfahren, welches neben dem Nachweis auch eine Quantifizierung der Viruslast ermöglicht.