Fachbereich Veterinärmedizin


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    Hepatitis-C-Virus-Pseudotypen und deren Einsetzbarkeit in der virologischen Diagnostik (2012)

    Art
    Hochschulschrift
    Autor
    Pfaff, Kerstin
    Quelle
    Berlin: Mensch & Buch Verlag, 2012 — 227 Seiten
    ISBN: 978-3-86387-206-9
    Verweise
    URL (Volltext): http://www.diss.fu-berlin.de/diss/receive/FUDISS_thesis_000000038954
    Kontakt
    Institut für Virologie

    Robert-von-Ostertag-Str. 7-13
    Gebäude 35
    14163 Berlin
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    viro@zedat.fu-berlin.de

    Abstract / Zusammenfassung

    Hepatitisviren B und C stellen weltweit ein erhebliches medizinisches Problem und eine Bedrohung der Weltgesundheit dar. Insbesondere die Infektion mit HCV ist in der ganzen Welt eine der häufigsten Ursachen für chronische Lebererkrankungen. Der Erfolg der zumeist einjährigen Therapie mit PEG IFN und dem Nukleosidanalogon Ribavirin hängt von verschiedenen bisher noch unzureichend erforschten Faktoren (z. B. von dem infizierenden HCV-Genotyp) ab.
    Die Erforschung des HCV war erschwert durch den Fakt, dass es lange Zeit nicht möglich war HCV in ausreichender Menge und stabil in der Zellkultur anzuzüchten. Um die dadurch bedingten Schwierigkeiten zu umgehen, wurden HCV pseudotypisierte Viren (HCVpp) entwickelt. Sie bieten die Möglichkeit, die funktionelle und infektiöse Form von HCV zu untersuchen, da sie diese imitieren und für bestimmte Zielzellen infektiös sind. Mithilfe dieser HCVpp wurde in vorliegender Arbeit ein Neutralisationstest etabliert. Es wurden definierte Kontrollseren und Seren von Patienten, die an einer Therapiestudie teilgenommen hatten, auf ihre Neutralisationsfähigkeit untersucht.
    Die HCVpp, die für die Versuche verwendet wurden, tragen E1 und E2 HCV Genotyp 1a Hüllproteine auf retroviralen oder lentiviralen Corepartikeln und sind mit einem GFP-Markergen ausgestattet, welches leicht mittels durchflusszytometrischer Technik (FACS) detektierbar ist.
    In vorliegender Arbeit wurden diese HCVpp, mit HCV 1a Hüllglykoproteinen, als Basis für den Neutralisationstest eingesetzt.
    Zu Beginn musste das Testsystem etabliert und optimiert werden, um festzustellen, ob HCVpp überhaupt als verlässliches Neutralisationstest-Medium eingesetzt werden können. Hierzu wurden Versuche mit unterschiedlichen Vektoren, Zellkulturmedien und Polybrene, als Transfektionsverstärker, durchgeführt. Es zeigte sich, dass HCVpp mit lentiviralen Corepartikeln als Vektor und mit hochwertigen Nährmedien hergestellt, die besten Ergebnisse in der Höhe der infektiösen Partikelzahlen ergaben. Außerdem konnten diese durch den Zusatz von PB ebenfalls verbessert werden.
    Zusätzlich wurden Zelltropismusstudien mit verschiedenen B-Suspensionszelllinien und HCVpp ausgeführt, jedoch war keine der untersuchten Zelllinien für eine Infektion mit HCVpp empfänglich und daher nicht für den Neutralisationstest einzusetzen.
    Nach der Optimierung der HCVpp wurden Neutralisationsversuche mit verschiedenen Patientenseren durchgeführt. Diese stammten von nicht HCV-infizierten Patienten, von Patienten, deren HCV-Screening Ergebnisse uneindeutig waren, von Patienten, mit unterschiedlichen HCV-Genotypen infiziert, von HIV/HCV-koinfizierten Patienten und von Patienten, die mit anderen Flaviviren (Dengue- und FSME-Virus) infiziert waren. Die Erprobung des Testsystems ergab, dass HCVpp zuverlässig durch die in den Serumproben enthaltenen nAk neutralisiert wurden und negative Proben verlässlich als solche erkannt wurden. Es konnte eine eindeutige Kreuzneutralisation mit anderen Genotypen beobachtet werden und eine Neutralisation durch Seren die AK gegen andere Flaviviren aufweisen ausgeschlossen werden.
    Obwohl die Messung von anti-HCV Antikörpern als diagnostisches Mittel in der klinischen Routinediagnostik eingesetzt wird, kann sie jedoch keine relevanten Informationen über den Krankheitsverlauf oder den möglichen Erfolg einer Therapie liefern. Ein Modellsystem zur Messung von neutralisierenden Antikörpern, wie in vorliegender Arbeit, könnten Erkenntnisse liefern, die es ermöglichen, rechtzeitig individuelle Behandlungen zu modifizieren und auf die Bedürfnisse des Patienten abzustimmen.
    Aus diesem Grund wurden, mit dem oben beschriebenen System, Folgeseren von chronisch HCV-infizierten Patienten untersucht, die sich einer Therapie unterzogen haben und bei denen ein unterschiedlicher Ausgang der Therapie („andauerndes Ansprechen auf die Therapie“, „Rezidiv nach initialem Ansprechen auf die Therapie“ und „kein Ansprechen auf die Therapie“) beobachtet werden konnte. Obwohl neuere Literaturquellen mit einem größeren Patientenkollektiv einen Zusammenhang zwischen der Höhe nAK und dem Verlauf einer HCV-Therapie bestätigen, konnten die in dieser Arbeit vorgelegten Ergebnisse des HCVpp-Neutralisationstests keinen Hinweis als prognostischer Marker auf einen Zusammenhang des Therapieverlaufs und der neutralisierenden Antikörperantwort geben.
    Jedoch konnte gezeigt werden, dass die in dieser Arbeit erzeugten HCVpp ein Surrogat-System darstellen, um in Patientenseren nAK zu messen. Ein Einsatz dieses, auf HCVpp basierenden Neutralisationstests in der klinischen Routinediagnostik wäre eine Möglichkeit, um künftig größere Patientenkollektive zu untersuchen und größere Datenmengen erheben zu können. Dadurch könnten die HCV-Therapiemöglichkeiten erheblich verbessert und individueller angepasst werden. Denkbar wäre auch der Einsatz im Blutspendewesen, um in im Screening auffällige Proben zuverlässig auf eine HCV-Infektion zu untersuchen. Außerdem ist die Möglichkeit der Anwendung dieses Neutralisationstests zu HCV Forschungszwecken eine Option, die lange Zeit nicht zur Verfügung stand und weiterhin wichtige Erkenntnisse über eine HCV-Infektion liefern kann.