Fachbereich Veterinärmedizin


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    Phosphorylierungsstatus und Verteilungsmuster von Beta-Catenin in bovinen Embryonen um den Zeitpunkt der Aktivierung des embryonalen Genoms (2012)

    Art
    Hochschulschrift
    Autor
    Leitner, Heidi
    Quelle
    Berlin: Mensch & Buch Verlag, 2012 — 136 Seiten
    ISBN: 978-3-86387-117-8
    Verweise
    URL (Volltext): http://www.diss.fu-berlin.de/diss/receive/FUDISS_thesis_000000036411
    Kontakt
    Institut für Veterinär-Biochemie

    Oertzenweg 19 b
    14163 Berlin
    +49 30 838 62225
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    Abstract / Zusammenfassung

    Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, das Verhalten von ß-Catenin während der frühen präimplantatorischen Embryonalentwicklung, insbesondere während des kritischen 8-Zellstadiums, näher zu analysieren, um Hinweise auf eine mögliche Funktion von ß-Catenin während dieser Entwicklungsphase zu erhalten. Hierzu wurden neben der Höhe des Gesamtproteinlevels von ß-Catenin auch dessen Phosphorylierungsstatus sowie das Verteilungsmuster von Gesamt-ß-Catenin (GBC) und phosphoryliertem ß-Catenin betrachtet. Dabei lag das Hauptaugenmerk auf N-PBC (an Ser33/Ser37/Thr41 phosphoryliertes ß-Catenin), dessen Funktion durch den Einsatz eines GSK3-Inhibitors noch genauer untersucht werden sollte. Darüber hinaus wurden zusätzlich das Proteinlevel und die Lokalisation von C-PBC (an Ser552 phosphoryliertes ß-Catenin) betrachtet. FRAP-Analysen von YFP-markiertem ß-Catenin dienten der Analyse von Translokationsprozessen innerhalb des Embryos. Auf diese Weise sollte das Wissen bezüglich der grundlegenden Mechanismen, die während der in diesem Zeitraum stattfindenden embryonalen Genomaktivierung und der folgenden ersten Differenzierungsprozesse eine Rolle spielen, verbessert werden. Durch eine Erweiterung des Wissens auf diesem Gebiet könnte ein Beitrag geleistet werden, langfristig die Technik der In-vitro-Produktion boviner Embryonen zu verbessern.
    ß-Catenin war vom 4-bis zum 16-Zellstadium in konstant hohen Proteinlevels nachweisbar und stammt somit aus maternaler und embryonaler Genaktivität. In den untersuchten Entwicklungsstadien war es nur in geringem Maß an Ser33/Ser37/Thr41 phosphoryliert. Allerdings zeigte der gegen N-PBC gerichtete Antikörper im Westernblot zusätzlich ein deutliches Signal mit NIP, einem noch nicht näher identifizierten Protein von geringerem Molekulargewicht. Hierbei könnte es sich um ein phosphoryliertes Splicing-oder Spaltprodukt oder um ein von ß-Catenin völlig unabhängiges Protein handeln. Da bei der Analyse des Verteilungsmusters nicht zwischen NIP und N-PBC unterschieden werden konnte, beziehen sich die diesbezüglichen Angaben auf beide Proteine, die hierfür unter der Bezeichnung SHEP (Summe homologer Epitope aufweisender Phosphoproteine) zusammengefasst wurden. C-PBC schien in größeren Mengen vorhanden zu sein als N-PBC.
    In den untersuchten bovinen Präimplantationsembryonen lag GBC überwiegend membranständig vor. Ein geringerer Anteil befand sich im Zytoplasma, wobei hier eine im Entwicklungsverlauf zunehmende perinukleäre Verdichtung (Corona) auszumachen war. In sehr kleinen Mengen war ß-Catenin auch im Zellkern zu finden. Die durchgeführten FRAP-Analysen zeigten, dass es im Lauf der präimplantatorischen Embryonalentwicklung zu einer Translokation von zytoplasmatischem ß-Catenin in den Zellkern kam, was auch in Zusammenhang mit der perinukleären Verdichtung stehen könnte. Überraschenderweise schienen sich überwiegend die phosphorylierten Varianten von ß-Catenin, SHEP und C-PBC, im Zell¬kern anzureichern. Dies widerspricht der am nächsten liegende Vermutung, dass ß-Catenin unter dem Einfluss von Wnt-Signalen in den Zellkern transloziert, da in diesem Fall an den Aminosäureresten Ser33, Ser37 und Thr41 hypophosphoryliertes ß-Catenin zu erwarten wäre. Dennoch spricht die Tatsache, dass die Phosphoproteine offensichtlich im Zellkern akkumulierten und sich bezüglich ihrer Lokalisation dabei zunehmend auf bestimmte Kernbereiche konzentrierten (Bildung von nuclear bodies), dafür, dass sowohl SHEP als auch C-PBC eine physiologische Funktion während der frühesten Embryonalentwicklung innehaben könnten.
    Der Einsatz des GSK3-Inhibitors führte nicht zu dem erwarteten Rückgang des N-PBC-Levels und der damit in Zusammenhang stehenden Akkumulation von dephosphoryliertem ß-Catenin. Eine derartige Stimulierung des Wnt-Signalwegs ist aus ähnlichen Versuchen an somatischen Zellen bekannt. Nichts desto trotz waren unter Inhibitoreinfluss gewisse Effekte sichtbar, insbesondere, was das Verteilungsmuster von GBC und SHEP betrifft. So kam es zu einer Verringerung des nukleären SHEP-Levels verbunden mit einem Rückgang des Anteils von Embryonen mit nuclear bodies und Corona. Dies deutet darauf hin, dass GSK3 auch bei frühesten Entwicklungsstadien bereits eine funktionelle, allerdings vom Wnt-Signalweg vermutlich unabhängige Rolle spielt.
    Insgesamt deutete sich an, dass es um den Zeitpunkt der embryonalen Genomaktivierung herum in bovinen Embryonen zu interessanten, jedoch teils unerwarteten und noch nicht abschließend erklärbaren Phänomenen das Verhalten von ß-Catenin betreffend kommt. Gleichwohl scheint dieses Protein durchaus eine Rolle in dieser frühen Entwicklungsphase zu spielen. Um diesbezüglich genauere Interpretationen zu ermöglichen, sind im Rahmen zukünftiger Forschungsarbeiten detailliertere Untersuchungen, insbesondere unter Einbeziehung weiterer Signalkaskaden, nötig.