Fachbereich Veterinärmedizin


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    Proteolytische Aktivität von APC bei der Inaktivierung verschiedener Faktor VIII-Präparate und bei der Faktor VIIIa-Inaktivierung in Gegenwart eines APC-DNA-Aptamers (2012)

    Art
    Hochschulschrift
    Autor
    Dücker, Christina
    Quelle
    Berlin: Mensch & Buch Verlag, 2012 — 109 Seiten
    ISBN: 978-3-86387-174-1
    Verweise
    URL (Volltext): http://www.diss.fu-berlin.de/diss/receive/FUDISS_thesis_000000038197
    Kontakt
    Institut für Veterinär-Physiologie

    Oertzenweg 19 b
    14163 Berlin
    +49 30 838 62600
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    Abstract / Zusammenfassung

    In der vorliegenden Arbeit wurde im ersten Abschnitt überprüft, ob Unterschiede in der proteolytischen Aktivität von APC bei der Inaktivierung von fünf aktivierten humanen pb- und fünf rFVIII-Präparaten sowie Unterschiede in den APC-Sensitivitäten dieser FVIIIPräparate zu ermitteln sind. Zu Beginn der Untersuchungsreihe wurden die eingesetzten FVIII-Präparate funktionell analysiert. Hierzu wurde untersucht, ob Unterschiede in der vergleichenden Aktivitätsbestimmung durch verschiedene Messmethoden und in der Thrombin-vermittelteten Aktivierung der zehn humanen FVIII-Präparate zu ermitteln sind.
    Die vergleichende Aktivitätsbestimmung der FVIII-Präparate mit zwei verschiedenen aPTT-basierten koagulometrischen Messungen und einem chromogenem Peptid-Substrat-Assay zeigte deutliche Ergebnisdiskrepanzen innerhalb der verschiedenen Messmethoden. In den Gerinnungszeitmessungen wurden dabei höhere FVIII-Bestimmungswerte gemessen. Außerdem wurde festgestellt, daß pbFVIII-Präparate signifikant höhere Aktivitäten in allen drei Bestimmungen aufwiesen. Die erzielten Resultate repräsentieren die bestehende schwierige Situation, den Gehalt an FVIII in Gerinnungskonzentraten oder Plasmaproben exakt zu bestimmen. Neben Aspekten zur Testdurchführung wurden als vorrangige Ursachen für die in dieser Arbeit erreichten Versuchsergebnisse mögliche Einflüsse der FVIII-Molekülstruktur, Herstellungsverfahren und Inhaltsstoffe, wie Von-Willebrand-Faktor und aktiviertem FVIII (FVIIIa), vermutet.
    Ermittelt wurden deutliche Unterschiede zwischen der Gruppe der plasmabasierten und der Gruppe der rekombinanten FVIII-Präparate bei der Aktivierbarkeit durch Thrombin. Aus Plasma gewonnene FVIII-Konzentrate erreichten eine statistisch signifikant höhere Thrombin-induzierte Aktivitätsbildung. Die Gruppe der rekombinanten FVIII-Konzentrate bildeten in den Aktivierungsversuchen ihre maximalen Aktivitäten durch eine geringere Menge an Thrombin aus als plasmabasierte FVIII-Konzentrate, was auf eine höhere Thrombin-Sensivität der rFVIII-Präparate hinweist.
    Faktor VIII-Aktivierungsexperimente mit reduzierter pbFVIII-Menge sowie erhöhter rFVIII-Menge ließen nicht ausschließen, dass aus Plasma gewonnene FVIII-Präparate Inhaltsstoffe aufweisen, die die Aktivität von Thrombin hemmen. Der aufgebaute Thrombin- Neutralisationstest zum Nachweis von möglichen Thrombin-Inaktivatoren zeigte keine Hinweise dafür, dass plasmabasierte FVIII-Konzentrate thrombin-inhibierende Einheiten beinhalten, die einen Einfluss auf die Aktivität von Thrombin ausüben. Aufgrund der erzielten Ergebnisse wurde dem etablierten Assay die Fähigkeit zugewiesen, einen Thrombin- Inaktivator nachzuweisen, der mindestens über ein fünfzehntel der Stoffmengenkonzentration von Thrombin verfügt.
    Die ermittelten FVIIIa-Restaktivitäten, die nach der Inkubation mit APC vorlagen und die jeweiligen IC50-Werte wurden zum Vergleich der proteolytischen Inaktivierung der FVIII Präparate durch APC und zur Analyse der APC-Sensitivität der einzelnen Präparate herangezogen.
    Unterschiede bei der proteolytischen APC-Aktivität bezüglich der Spaltung von FVIIIa verschiedener FVIII-Präparate wurde nicht festgestellt.
    Die IC50-Werte lagen in einem Bereich von 0,81 und 1,99 nM. Das Versuchsergebnis weist darauf hin, dass plasmabasierte und rFVIII-Präparate vergleichbare APC-Senstivitäten besitzen.
    Ziel des zweiten Abschnitts der Dissertation war, den Einfluss der von der Arbeitsgruppe hergestellten APC-Aptamere HS02 auf die proteolytische Aktivität von APC in Hinblick auf die APC-induzierte FVIIIa-Inaktivierung zu prüfen.
    Es konnte gezeigt werden, dass das in seiner Originalsequenz 88 Nukleotide umfassende Aptamer HSO2-88 die antikoagulatorische Aktivität von APC fast vollständig inhibiert. Bei einem 100-fachen molaren Aptamer-Überschuss von HS02-88 im Verhältnis zum eingesetzten APC konnte die Reduzierung der FVIIIa-Aktivität auf 10 % limitiert werden. Hinweise dafür, dass durch die Aptamere die Mitglieder des intrinsischen Tenase-Komplexes in ihrer Aktivität beeinflusst werden, konnten anhand von APC-freien Kontrollen nicht gefunden werden.
    Anhand der ermittelten IC50-Werte wurde als Minimalmotiv die Aptamer-Variante HS02-44G identifiziert. Durch Einsatz der Aptamere HS02-88 und HS02-44G konnte eine signifikante Verlängerung der FVIIIa-Halbwertszeit im untersuchten Zeitraum von 30 Minuten erreicht werden.
    Aus den Versuchsergebnissen wurde gefolgert, dass essentielle Sekundärstrukturelemente für die Bindung des Aptamers an APC eine aus minimal 44 Nukleotiden gebildete Stem-Loop- Struktur mit der enthaltenen Konsensussequenz aus 14 Nukleotiden sowie ein CTBasenüberhang sind.
    Die Daten legen nahe, dass die Bindungsstelle des Aptamers im Bereich einer durch basische Aminosäurereste positiv geladenen Oberflächenregion der Proteasen-Domäne des APCMoleküls lokalisiert ist.
    HS02-Aptamere bieten das Potential, als spezifische Inhibitoren der proteolytischen APCAktivität bei der FVIIIa-Inaktivierung in der Hämophilia A Behandlung zu wirken. In diesem Zusammenhang könnten die Aptamere einsetzbar sein als potentielles Adjuvants, um den Verbrauch an FVIII-Konzentraten in der Substitutionstherapie zu verringern. HS02-Aptamere könnten daneben auch nutzbringend sein als mögliches APC-Antidot und in der Diagnostik zur Bestimmung des APC-Spiegels im Plasma.